Структура коровой части репликазы фага Θβ

• Автор: Васильев, Никита Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Использованные сокращения
Введение
1. Обзор литературы
1.1. РНК-содержащие вирусы
1.1.1. Бактериофаг Qß
1.2. Qß-репликаза
1.2.1. Матрицы Qß-репликазы
1.2.2. Репликационный цикл Qß-репликазы
1.2.3. Субъединичный состав Qß-репликазы
1.2.4. Структура Qß-репликазы
1.3. Структура и функции РНК-зависимых РНК-полимераз
1.3.1. Инициация синтеза РНК
1.3.2. Элонгация полинукпеотидной цепи
1.3.3. Образование комплекса вирусных РНК-зависимых РНК-
полимераз с клеточными белками
1.4. Заключение
2. Материалы и методы
2.1. Микробиологические методы
2.1.1. Штаммы Escherichia coli
2.1.2. Микробиологические среды
2.1.3. Трансформация
2.2 Методы работы с нуклеиновыми кислотами
2.2.1. Плазмиды
2.2.2. Аналитическое выделение плазмидной ДНК
2.2.3. Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.4. Фенольная обработка нуклеиновых кислот
2.2.5. Осаждение нуклеиновых кислот этанолом

2.2.6. Транскрипция in vitro
2.3. Методы работы с белками
2.3.1. Получение коровой части Qp-репликазы дикого типа
2.3.2. Получение коровой части Qp-репликазы, содержащей слитые
факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts
2.3.3. Получение холофермента Qp-репликазы дикого типа и Qp-
репликазы, содержащей слитые факторы элонгации
2.3.4 Получение химерной Qp-репликазы, содержащей EF-Ts из
T. thermophilus
2.3.5. Получение Hise-модифицированного фактора элонгации EF-Ts из
Т. thermophilus
2.3.6. Определение концентрации белка по методу Лоури
2.4. Реакции с участием Qp-репликазы
2.4.1. Определение активности Qp-репликазы в лизатах клеток
2.4.2. Определение специфической активности Qp-репликазы в
очищенных препаратах
2.4.3. Обмен фактора элонгации EF-Ts в составе Qp-репликазы на
фактор EF-Ts из Т. thermophilus
2.4.4. Репликация RQ135 РНК
2.4.5. Образование комплексов QP-репликазы с RQ135 РНК
2.5. Кристаллизация Qp-репликазы
2.5.1. Кристаллизация Qp-репликазы дикого типа и химерной QP-
репликазы, содержащей Tth EF-Ts
2.5.2. Кристаллизация коровой части Qp-репликазы, содержащей
слитые факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts
2.6. Определение структуры коровой части Qp-репликазы
2.7. Электрофоретические методы
2.7.1. Электрофорез нуклеиновых кислот
2.7.2. Очистка РНК с помощью электрофореза и последующей элюции
из геля

2.7.3. Денатурирующий электрофорез белков
2.7.4. Электрофорез РНК-белковых комплексов в неденатурирующих условиях
3. Результаты
3.1. Цели и экспериментальные задачи
3.2. Освобождение Qp-репликазы от белка S1
3.3. Замена факторов элонгации в составе Qp-репликазы на аналоги из
Therm us thermophilus
3.3.1. Получение препарата фактора элонгации EF-Ts из Thermus thermophilus
3.3.2. Обмен фактора элонгации EF-Ts в составе Qp-репликазы на аналог из Т. thermophilus
3.3.3. Получение химерной Qp-репликазы in vivo
3.3.4. Выделение химерной Qp-репликазы
3.3.5. Субъединичный состав химерной Qp-репликазы
3.3.6. Ферментативная активность химерной QP-репликазы
3.3.7. Кристаллизация химерной Qp-репликазы
3.4. Слитая Qp-репликаза
3.4.1. Выделение слитой репликазы
3.4.2. Ферментативная активность слитой Qp-репликазы
3.4.3. Кристаллизация слитой Qp-репликазы
3.5. Структура Qp-репликазы
3.5.1. Определение пространственной структуры
3.5.2. Структура коровой части Qp-репликазы
3.5.3. Сравнение структуры каталитической субъединицы с известными структурами РНК-зависимых РНК-полимераз
3.5.4. Модель элонгационного комплекса Qp-репликазы
3.5.5. Сравнение со структурой Qp-репликазы, опубликованной другими авторами
взаимодействии с Qß-PHK факторы элонгации теряют способность сшиваться с остальными субъединицами, но не между собой Эти данные дают основание полагать, что основные структурные изменения, происходящие при взаимодействии- репликазы с РНК, затрагивают место контакта двух субкомплексов в составе Qß-репликазы (S1*ß и EF-Tu*EF-Ts), принтом факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts остаются в виде комплекса.
Пространственная структура каталитической ß-субъединицы неизвестна. Как было сказано выше, в свободном виде, ß-субъединица не только лишена ферментативной активности, но и является нестабильной в растворе, что делает невозможным ее кристаллизацию. Изучение структуры- каталитической субъединицы в виде полной Qß-репликазы с помощью методов рентгеноструктурного анализа так же затруднено, что связано с белком S1, входящим в состав комплекса и препятствующим кристаллизации фермента.
В отличие от Qß-репликазы и репликаз родственных бактериофагов для многих РНК-вирусов решены пространственные структуры РНК-зависимых РНК-полимераз и их функциональных комплексов. Изучение структуры функциональных комплексов РНК-репликаз позволили не только значительно дополнить данные биохимических исследований, но и, изучить механизмы отдельных стадий репликационного цикла на структурном уровне.
1.3. Структура и функции РНК-зависимых РНК-полимераз
Одной из первых была расшифрована пространственная структура РНК-репликазы вируса полиомиелита [Hansen et al., 1997]. При сравнении полученной структуры с уже известными структурами полимераз трех других типов (ДНК- и РНК-зависимых РНК-полимераз и РНК-зависимой ДНК-полимеразы) было обнаружено, что все типы полимераз имеют сходное строение (Рис. 6).