Генетический контроль гомеостаза ионов кальция у дрожжей рода Ogataea

• Автор: Фокина, Анастасия Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
Введение
Обзор литературы. Кальций в секреторном пути дрожжей: поддержание
баланса в органеллах и участие в процессе секреции белка
1. Этапы секреции белков
1.1. Транслокация белка из цитозоля в эндоплазматический ретикулум (ЭР)
1.2. Гликозилирование
1.2.1. Ы-гликозилирование
1.2.2. О-гликозилирование
1.2.3. Присоединение гликозилфосфатидилинозитольного якоря
1.3. Укладка белков и сборка белковых комплексов в ЭР
1.4. Внутриклеточная система транспорта секреторных белков
1.4.1. Комплексы окаймления СОРИ и СОРТ участвуют в транспорте белков между ЭР и
аппаратом Гольджи
1.4.2. Транспорт секретируемых белков через аппарат Г ольджи
1.4.3. Клатриновое окаймление участвует в транспорте белков из поздних компартментов
аппарата Г ольджи в лизосомы (вакуоль) и от плазматической мембраны в аппарат Гольджи или лизосому (вакуоль)
1.5. Протеолитический процессинг
1.6. Деградация белков в секреторных путях
1.6.1. Контроль качества укладки белков в ЭР
1.6.2. Ответ клетки на накопление неправильно свернутых белков (иРЙ)
1.6.3. Деградация белков, ассоциированная с эндоплазматическим ретикулумом
(1:1<А1.>)
1.6.4. Деградация белков в вакуоли
2. Баланс ионов кальция и марганца в клетке и его влияние на физиологические
процессы
2.1. Гомеостаз ионов кальция
2.1.1. Кальциевые АТФазы
2.1.2. Кальциевые АТФазы дрожжей и проявления мутаций в генах, их кодирующих
2.1.3. Каналы, проводящие ионы кальция, у дрожжей

2.1.4. Роль ретроградного везикулярного СОР 1-транспорта в поддержании гомеостаза
кальция в клетке
2.1.5. Кальциневрин — ключевой эффектор кальций-зависимой регуляции различных
физиологических процессов
2.1.5.1. Роль кальциневрина в регуляции гомеостаза ионов кальция
2.1.5.2. Роль сигнального пути кальциневрина в регуляции биогенеза клеточной стенки, формировании почки и клеточного цикла
2.1.5.3. Роль кальциневрина в сигнальном пути запрограммированной смерти клетки
2.2. Гомеостаз ионов марганца и его регуляция
2.2.1. Общая характеристика транспортеров ионов металлов семейства Nramp
2.2.2. Транспортеры Smflp и Smf2p ионов марганца у дрожжей S. cerevisiae
2.2.2.1. Bsd2p контролирует транспортеры Smflp и Smf2p при физиологической концентрации ионов марганца
2.2.22. Регуляция Smflp и Smf2p при дефиците ионов марганца
2.2.2.3. Регуляция Smflp в условиях избытка ионов марганца
2.2.2.4. Регуляция Smflp ионами кадмия
2.2.3. Pmrlp как транспортер марганца
2.2.4. Транспорт марганца в вакуоль
2.3. Взаимозаменяемость ионов кальция и марганца
Цели и задачи
Материалы и методы
1. Штаммы микроорганизмов
1.1. Виды и штаммы дрожжей рода Ogataea
1.1.1. Получение штамма 1 В-Дртс О. polymorpha
1.1.2. Получение штамма lMA27/12GA 1.1.3. Получение шатаммов 64MA70Q и 64MA70U О. polymorpha
1.1.4. Получение изогенных штаммов О. polymorpha, отличающихся аллелью гена RET1, и
содержащих экспрессионные кассеты иРА и uPA-Q302
1.1.5. Получение штаммов О. polymorpha для изучения совмещения мутаций pmcl-A и

1.1.6. Получение штаммов О. polymorpha с мутациями, супрессирующими рте!Д
1.2. Штаммы Escherichia coli
2. Плазмиды

3. Состав сред и условия для выращивания микроорганизмов
3.1. Среды для выращивания E
3.2. Среды для выращивания дрожжей
3.3. Условия культивирования
4. Методы
4.1. Трансформация клеток E. coli SEM (Inoue H. et ed., 1990) с модификациями
4.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli методом щелочного лизиса (Sambrook J.
et al., 1989) с модификациями
4.3. Манипуляции с ДНК in vitro
4.3.1. Проведение реакции ферментативного расщепления ДНК эндонуклеазами
4.3.2. Переосаждение ДНК после рестрикции для очистки от эндонуклеаз и смены
буфера
4.3.3. Лигирование
4.3.4. Электрофорез в агарозном геле
4.3.5. Препаративный электрофорез и выделение ДНК из 1% агарозного геля
4.3.6. Проведение полимеразной цепной реакции
4.4. Выделение и анализ ДНК дрожжей рода Ogataea
4.5. Трансформация дрожжей рода Ogataea
4.6. Методы работы с белками
4.6.1. Тестирование ферментативной активности иРА
4.6.2. Индукция экспрессии иРА в штаммах дрожжей рода Ogataea
4.6.3. Измерение суммарного клеточного белка
4.6.4. Электрофорез и иммуноблоттинг
4.6.5. Анализ иРА из культуральной среды
4.6.6. Приготовление дрожжевых лизатов
4.7. Анализ чувствительности дрожжей рода Ogataea к содержанию в среде ионов
кальция, SDS, сорбитола и NaCI
4.8. Изучение влияния Мп2+ на рост мутантов О. polymorpha с нарушением гомеостаза
кальция
4.9. Анализ чувствительности дрожжей рода Ogataea к содержанию в среде ЭТТА
4.10. Измерение активности ß-галактозидазы
4.1 1. Анализ механизма гибели двойного мутантаpmrlts ret 1-27 О. polymorpha

2.2.1. Общая характеристика транспортеров ионов металлов семейства Nramp
Семейство Nramp представляет собой большой класс транспортеров ионов металлов, которые сильно консервативны от бактерий до человека (Cellier М. et al., 1995). Транспортеры Nramp, находясь как в плазматической мембране, так и в мембранах везикул и органелл, осуществляют транслокацию двухвалентных металлов, таких как марганец, железо, кобальт, медь, цинк и кадмий, через мембрану в направлении цитозоля, сопрягая этот перенос с транспортом ионов водорода в соотношении 1:1 (Cellier М. et al., 1995; см. обзоры Andrews, N. С., 2000; Forbes J. R and Gros P., 2001; Nelson, N., 1999; Courville P., et al., 2006).
Все транспортеры семейства Nramp обладают очень консервативным ядром из 10 трансмембранных доменов. Также очень консервативным является отвечающий за транспорт металла мотив цитоплазматической петли между 8 и 9 доменами (Courville P. et al., 2006). Известны и некоторые основания в составе трансмембранных доменов, мутации которых приводят к потере транспортной активности беков - это D93 Е154 и D192 из, соответственно, 1, 3 и 4 доменов.
2.2.2. Транспортеры Smflp и Smf2p ионов марганца у дрожжей S. cerevisiae
Изначально белки Smflp и Smf2p были идентифицированы в 1992 г. у S. cerevisiae как мультикопийные супрессоры нарушения процессирования митохондриальных белков, без какой-либо связи с металлами или транспортом (West А. H. et al., 1992). Примерно в то же время в мышах был идентифицирован белок Nrampl, как играющий важную роль в иммунном ответе (Vidal S. М. et al., 1993). В 1995 году, Nramp определили как большое семейство транспортеров двухвалентных металлов (Cellier М. et al., 1995), и показали, что Smflp является высокоафинным транспортером марганца (Supek F. et al., 1996). Таким образом, оказалось, что ранее описанная роль Smflp в импорте митохондриальных белков отражала активацию марганцем одного из шагов процессирования митохондриальных белков.
Как и другие белки семейства Nramp, Smflp и Smf2p не специфичны к одному металлу, при сверхэкспрессии эти транспортеры способны переносить множество разных металлов: кадмий, кобальт, медь, железо, кальций и цинк (Chen X.-Z. et al., 1999; Cohen A. et al., 2000; Liu X. F. et al., 1997; Gunshin H. et al., 1997).