Диссертация на тему "Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза и детекции его возбудителя", скачать бесплатно автореферат по специальности 03.00.07

Введение
Глава 1 Современное состояние лабораторной диагностики и пути расширения арсенала методов идентификации леитоснир обзор литературы
1.1 Распространение лептоспир, взаимодействие с факторами внешней среды и живыми организмами

1.2 Лабораторные методы выделения, культивирования и идентификации лептоспир

1.3 Методы получения и применения иммуносорбционных систем для выявления бактерий

Собственные исследования

Глава 2 Материалы и методы

2.1 Материалы

2.1.1 Штаммы микроорганизмов

2.1.2.Питательные среды и условия культивирования

2.1.3 Лабораторные животные

2.1.4 Клинический материал
2.1.5 Характеристика реагентов, используемых для получения иммуносорбентов
2.2 Методы исследования
2.2.1 Микроскопия лептоспир
2.2.2 Получение антигенных комплексов микроорганизмов
2.2.3 Иммунизация животных
2.2.4 Выделение иммуноглобулинов
2.2.5 Методы контроля специфичности и активности антигенов и сывороток
2.2.6 Получение иммунофлуоресцирующих конъюгатов
2.2.7 Экстракция фосфолипидов ФЛ
2.2.8 Получение и контроль липосом
2.2.9 Получение и кот роль иммуноферментных конъюгатов
2.2. Физикохимические методы
2.2. Иммунохимические методы анализа
2.2. Лиофилизация биологического материала
2.2. Методы математической и статистической обработки материалов Глава 3 Усовершенствование экспрессдиагностики лептоспироз
ной инфекции путем разработки иммобилизованных препаратов с магнитными свойствами и конструирования технических средств
3.1 Получение высокоспецифичной лептоспирозпой сыворотки
3.2 Разработка лептоспирозных магноиммуносорбенгных препаратов для выявления лептоспирозных антител, антигенов и компоновка тестсистем для выявления лептоспир
3.3 Мониторинг объектов внешней среды на наличие лептоспир с применением технических средств
Глава 4 Выявление лептоспир с использованием липосомальноиммунопсроксидазного конъюгата и суспензионного диагностикума
4.1 Получение и тестирование лептоспирозного липосомальноиммунопероксидазного конъюгата
4.2 Получение суспензионного диагностикума и проведение анализа суспензионной агглютинации лептоспир
4.2.1 Получение суспензионного диагностикума
4.2.2 Проведение анализа суспензионной агглютинации лептоспир
Глава 5 Исследование клинического и нолевого материала на наличие антител и антигена лептоспир
5.1 Изучение диагностической ценности предложенных тестсистем при исследовании клинического материала
5.2 Апробация разработанных тестсистем и технических устройств при исследовании полевого материала
Заключение
Практические рекомендации Список используемых источников
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
Аг ан тиген
лт антитело
бакмасса бактериальная масса
БСА бычий сывороточный альбумин
г грамм
и т.д. и так далее
ИФА иммуноферментный анализ
КББ карбонатбикарбонатный буфер
КИФЛ количественный иммунофлуоресцентный анализ
к.р.с. крупный рогатый скот
ЛПС липополисахарид
мг миллиграмм
МИБП медицинские иммунобиологические препараты
мин минута
мне магноиммуиосорбент
м.к. микробные клетки
мкг микрограмм
мкл микролитр
мкм микрометр
мл миллилитр
мс магносорбент
МУ методические указания
нм нанометр
НРИФ непрямая реакция иммунофлуоресценции
ООН особо опасные инфекции
Г1ААГ полиакриламидный гель
ПАФ полный адъювант Фрейнда
ГИДР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтиленгликоль
РА реакция агглютинации
РАЛ реакция агглютинации латекса
РИА радиоиммунологичсский анализ
РИД реакция иммунодиффузии
РИФ реакция иммунофлуоресценции
РМА реакция микроагглютинации
отрицательный логарифм концентрации водородных ионов
РТПГА
с
СтавНИПЧИ
С
ТСХ тыс. т.е.
ФЛ
ч
реакция непрямой гемагглютинации реакция торможения пассивной гемагглютинации реакция суспензионной агглютинации секунда
Ставропольский научноисследовательский противочумный институт сутки
градус Цельсия
твердофазный иммуноферментный метод
тонкослойная хроматография
то есть
флуоресцеинизотиоцианаг
фосфолипиды
фосфатносолевой буфер
этилендиаминЫ,Ы,Ч1,Ч1тетрауксусной кислоты динатриевая соль
раствор нормальный раствор
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность

Научнометодические разработки сочетанных методов использования МИС с ИФА и КИФА дополняют новыми научными данными сведения о возможности применения иммобилизованных систем, способствующих стабильности, увеличению чувствительности методов и проведению эффективной детекции лептоспир в объектах внешней среды и биологическом материале. Усовершенствованные ИФА и КИФА с применением полученных лептоспирозных МИС в сочетании с разработанными техническими средствами позволяют выявить лсптоспиры в объектах внешней среды, повысить чувствительность метода, сократить время анализа до 3 ч за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что в конечном итоге обеспечивает своевременное проведение адекватных противоэпидемических мероприятий. Применение разработанных аффинных сорбентов с магнитными свойствами обеспечивает эффективную иммуносорбцию неспецифических антител из сыворотки крови для получения высокоспецифичных препаратов. Разработанные методологические подходы по ковалентной фиксации на поверхности мембраны липосом ферментов и лептоспирозных иммуноглобулинов позволяют повысить стабильность и в два раза увеличить срок годности диагностической системы без потери активности с сохранением каталитических свойств. Предложен метод РСЛ на стекле с суспензионным диагностикумом, обладающий экономической эффективностью, экспрессностью и простотой, показано его преимущество перед традиционными методами детекции возбудителя при апробации в лабораторных и полевых условиях. Материалы научных разработок легли в основу 3 методических документов, утвержденных на учрежденческом уровне внедрения Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях протокол Ученого совета СтавНИПЧИ 9 от г. Лабораторная детекция лептоспироза протокол Ученого совета СтавНИПЧИ от г. Утверждена нормативная документация лабораторный регламент, инструкция по применению на диагностикум суспензионный для выявления лептоспир в РСЛ протокол Ученого совета СтавНИПЧИ 1 от г Материалы диссертации используются на курсах специализации врачей по экспрессдиагпостикс лептоспироза в ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора. Разработанные научнометодические подходы получения высокоспецифичных иммунных лептоспирозных сывороток для диагностических препаратов с применением аффинных МИС на основе полифепана и оксида железа обеспечивают сохранение их первоначальной активности, сокращение и упрощение всех этапов сорбции. Селективное концентрирование лептоспир путем применения разработанных магноиммуносорбентных диагностических препаратов, тестсистем и технических средств увеличивает чувствительность методов на 2
порядка по сравнению с традиционными ИФА и реакцией иммунофлуоресценции РИФ. Метод ИФА с липосомальноиммунопероксидазным конъюгатом позволяет выявлять лептоспиры в концентрации 5х5 микробных клеток м. Стабильность и срок годности конъюгата увеличены в 2 раза по сравнению с традиционным иммунопероксидазным конъюгатом Какапс Р. К., i А. Высокая эффективность обнаружения антигена лептоспир в РСА достигнута при использовании суспензионнофлуоресцентного алюмосиликатного диагностикума. Разработанный диагностикум но чувствительности аналогичен традиционному методу РИГА, но превосходит по простоте изготовления и экспрессности РСА мин, а РНГА макрометод ч. Разработанные диагностические тестсистемы могут использоваться в ходе мониторинга объектов внешней среды с целыо выявления и изучения циркуляции лептоспир, а также для лабораторной диагностики леитоспироза. Основные результаты диссертационной работы были представлены на III Российской конференции с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера г. Новосибирск, , на научнопрактической конференции Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины г. СНГ г. Саратов, . Основные положения диссертации отражены в опубликованных научных работах, в том числе одна работа в издании, рекомендованном ВАК РФ, две депонированы в ВИНИТИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников. Работа изложена на 0 страницах компьютерного текста, содержит таблиц и рисунков. Список литературы включает 9 отечественных и зарубежных источников.

Название работы	Автор	Дата защиты
Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus Intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus Subtilis на разных фазах роста	Михайлова, Екатерина Олеговна	2007
Роль ассоциативных ризосферных бактерий в формировании продуктивности кукурузы и изучение условий повышения эффективности ассоциативного взаимодействия	Хоанг Хай	2000
Генотипическая гетерогенность спирохет Borrelia afzelii - одного из возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов	Фадеева, Ирина Анатольевна	2006

Электронная библиотека диссертаций

Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза и детекции его возбудителя