Изучение возможности использования электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур

• Автор: Кандыба, Дмитрий Николаевич
• Шифр специальности: 06.01.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

Содержание
Введение
Цели и задач исследований
Научная новизна и практическая ценность работы
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Вирусные, фитоплазменные и вирусоподобные болезни
ягодных культур
1.2. Основные принципы и методы очистки вирусов и
вирусных белков
1.3. Особенности очистки непереносимых соком вирусов
1.4. Выделение и очистка вирусспецифических нуклеиновых кислот
1.5. Использование электрофореза белков для изучения и диагностики вирусов
1.6. Диагностика и анализ вирусов методом электрофореза нуклеиновых кислот
Глава 2. Материалы и методы
2.1. База исследований
2.2. Материалы и объекты исследований
2.3. Методика выделения и очистки вирусспецифических белков
2.4. Выделение и очистка вирусспецифических нуклеиновых кислот
2.5. Методика проведения электрофореза
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Очистка и выявление методом электрофореза специфического
белка вируса хлороза жилок малины (КУСУ)
3.2. Очистка и выявление методом электрофореза специфических белков вирусов крапчатости (БМУ) и морщинистости (БСУ) земляники
3.3. Очистка и выявление методом электрофореза специфических белков возбудителей вирусных и вирусоподобных болезней смородины
и крыжовника
3.4. Изучение возможности использования разработанной методики для выявления вирусов косточковых культур
3.5. Очистка и выявления методом электрофореза специфических РНК вирусов ягодных культур
3.6. Ожидаемый экономический эффект по использованию метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур
3.7. Обсуждение результатов
4. Выводы
5. Рекомендации по практическому использованию
6. Список литературы
7. Приложение

Введение
Ягодные культуры в сильной степени поражаются вирусными и фитоплазменными заболеваниями. К настоящему времени число выявленных вирусов и фитоплазм составляет на землянике -27, малине -25, смородине -14, на крыжовнике 9 (R.H. Converse, 1987). Вредоносность этих заболеваний может быть значительной. Так, израстание на малине и реверсия на смородине могут вызывать полное бесплодие насаждений (Ю.Н. Помазков, 1975). Потери урожая малины в результате заражения мозаикой могут достигать 53% (Г.Т. Борзых, 1975; A.A. Кузнецова, 1970), на землянике от вирусов крапчатости и морщинистости урожаи уменьшаются в 1,7 раза (О.О. Белошапкина, 1986; В.Ю. Минаев, 1985). Из-за внутриклеточного характера паразитирования и теснейшей взаимосвязи цикла развития вирусов с жизнедеятельностью растений-хозяев борьба с этими патогенами в существующих насаждениях невозможна. Единственный эффективный способ снижения их вредоносности в условиях многофакторной динамичной системы адаптивного садоводства является использование высококачественного оздоровленного посадочного материала (В. И. Кашин, 1995).
Производство оздоровленного посадочного материала и фитовирусологические исследования, в целом, в настоящее время невозможны без современных методов экспресс-диагностики вирусов. К одним из таких методов относится иммуноферментный анализ, основанный на производстве антисывороток к вирусам. Однако область применения этого метода довольно ограничена ввиду наличия целого ряда так называемых соконепереносимых вирусов, частицы ко-

добавляют мочевину в концентрации 4-8 М (C.Kerlan, J.Dunez, 1976). Процесс окисления белков и образование лишних дисульфидных мостиков предотвращают внесением в буфер 1-5% меркаптоэтанола (M.Alper et al., 1984; K.S.Derrick et al., 1988; М.В.Сапоцкий, 1993).
Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препарат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что и белки. Наибольшее распространение получил бромфеноловый синий (Л.А.Остерман, 1981).
Электрофорез белков проводят, в основном, в полиакриламидных гелях с концентраций от 5 до 20% по двум основным методикам (U.K.Laemmli, 1970 и
B.J.Davis, 1964). Большой популярностью пользуется гель, синтезированный как градиент плотности полиакриламида от 5 до 15% (М. Alper et al., 1984). Данный способ позволяет получить более полную картину структуры белков вирусов и одновременно экономит время и расход реактивов, так как при обычном методе пришлось бы синтезировать три геля (5; 10; 15%), а также образец (для обычного метода его пошло бы в три раза больше).
Продолжительность электрофореза белков вирусов составляет от 15 минут до 16 часов в зависимости от оборудования и условий проведения.
После проведения электрофореза гели окрашивают в растворе уксусной кислоты и метилового спирта; в качестве красителя могут быть использованы: амидо-чбрный (G. Wolf, R. Casper, 1971), куммаси ярко-голубой (С. Kerlan, J. Dunez, 1976; М. Alper et al., 1984) или нитрат серебра (К. S. Derrick et al., 1988). Продолжительность окрашивания зависит от используемого красителя и может длиться 2 часа. Завершается работа с гелем его документацией с помощью целлофана или фотографирования.
В настоящее время, применительно к вирусам, электрофорез белков преимущественно используется для изучения капсид вирионов и контроля качества очистки вирусных препаратов. Его применение для диагностики сокопереносимых вирусов потеряло своё значение ввиду разработки более технологичного метода иммуноферментного анализа. Однако на ягодных культурах метод элек-