Обоснование эффективности молекулярно-генетического подхода в изучении признаков риса, используемых в селекции и семеноводстве

• Автор: Токмаков, Сергей Вячеславович
• Шифр специальности: 06.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Краснодар
• Количество страниц: 137 с. : ил.

Содержание
Введение
1 Обзор литературы
1.1 Молекулярные маркеры и основные маркерные системы
1.2 Общие сведения о культуре Огуга «ай'та Ь
1.2.1 Общие сведения о биологии
1.2.2 Общие сведения о генетике
1.2.3 Разделение на подвиды тсИса и ]арошса
1.2.3.1 Физиолого-морфологические методы подвидовой идентификации
1.2.3.2 Молекулярно-генетические методы подвидовой идентификации
1.2.4 Феномен краснозёрности
1.2.4.1 Генетические основы признака окраска перикарпа
зерновки риса
1.2.4.2 Проблема диких и сорно-полевых форм риса
1.2.4.3 Переопыление сорно-полевыми формами риса
2 Материал и методы
2.1 Материал исследований
2.2 Подготовка растительного материала и экстракция ДНК
2.3 Нуклеотидные последовательности, использованные при разработке маркера к гену Ыс
2.4 Молекулярные маркеры, использованные в работе
2.5 Проведение полимеразной цепной реакции и электрофореза продуктов амплификации
2.6 Статистическая обработка данных
3 Результаты и обсуждение
3.1 Создание маркера к гену красной окраски перикарпа риса Ыс
Определение порога чувствительности методики и полевой
эксперимент
3.2 Изучение генетической основы феномена краснозёрных форм белозёрных сортов риса на основе молекулярно-генетического подхода
3.3 Поиск молекулярных маркеров, информативных для подвидовой идентификации растений Огуга вайа Ь
Выводы
Предложения для практической селекции
Список использованных источников

Введение
Актуальность проблемы.
Роль ДНК-технологий в современных сельскохозяйственных науках трудно переоценить. Несомненно, в значительной мере эта роль касается селекции, изучения генетического разнообразия и вопросов паспортизации сортов. Но кроме обозначенных вопросов с помощью ДНК-технологий можно решать и такие прикладные задачи, как защита авторских прав селекционеров, защита продукции растениеводства от фальсификации и определение её качества и генетической чистоты.
Возможности ДНК-маркеров во много раз превосходят потенциал изоферментов или запасных белков. Кроме того, проявление таких молекулярных маркеров нейтрально по отношению к фенотипу, не является тканеспецифичным и их можно обнаружить на любой стадии развития растений [Хавкин, 1997].
Ввиду высокой актуальности проблемы засоренности производственных посевов риса краснозерными формами для ее решения необходим комплексный научно-производственный подход, который предполагает глубокое знание генетических причин возникновения краснозерности. Особое значение здесь приобретает технология молекулярного маркирования.
Краснозёрная примесь бывает представлена так называемыми краснозёрными формами (КФ) районированных сортов. Габитусом они схожи с растениями возделываемых сортов по всем признакам, кроме окраски перикарпа.
Разработка методики идентификации гена окраски перикарпа риса Ыс, позволит проводить скрининг генетической плазмы для выявления краснозёрных растений на любом этапе селекционно-семеноводческой программы вне зависимости от фазы онтогенеза растений.
Использование микросателлитных маркеров позволяет выполнять широкий спектр задач для прикладной и фундаментальной науки. Помимо определения генетического родства и степени генетического разнообразия, с помощью

таких нейтральных, не сцепленных с каким либо признаком, маркеров можно отслеживать такие комплексные характеристики, как подвидовая принадлежность сортов риса - тсПса илидаротса.
Распространенные методы идентификации подвидов весьма сложны, комплексны и результаты их не всегда однозначны. В ряде работ можно найти расхождение в результатах при дифференциации сортообразцов на подвид т-сйса или ]аротса различными методами, связанными только с фенотипическим проявлением признака.
Наличие современной, удобной и точной методики подвидовой идентификации позволит упростить и ускорить селекцию риса на длиннозёрность.
Цель и задачи исследований.
Целью данного исследования являлась разработка методологических подходов использования молекулярно-генетических методов для идентификации краснозёрных форм и дифференциации генотипов риса на подвиды тсйсаДарошса.
В проводимых исследованиях были поставлены следующие задачи.
1) Выявить полиморфизм гена красной окраски перикарпа риса Л с и разработать праймерные пары, выявляющие аллельный полиморфизм при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР).
2) Определить порог чувствительности созданных аллельспецифичных праймеров к гену Лс при проведении ПЦР-анализа при различном соотношении ДНК образцов красно- и белозёрного риса в одной пробирке.
3) Провести изучение аллельного состояния гена Лс с помощью разработанной маркерной системы у растений трёх сортов риса в питомнике испытания потомств первого года (первичные звенья семеноводства).
4) Произвести попарное сравнение аллельного состояния микросател-литных локусов ДНК растений белозёрных сортов риса и их краснозёрных форм (КФ) и определить степень генетической близости изученных образцов.
5) Изучить генетическое разнообразие референсных сортообразцов подвидов тсйса и )арошса коллекции ВНИИ риса, используя микросател-

и найти применение в селекционных программах, в которые включены два различных подвида О. sativa.
SSR локусы риса довольно хорошо изучены. Был проведён сравнительный анализ полиморфизма SSR диких и культурных форм риса [Yang et al., 1994]. Различия в нуклеотидных последовательностях SSR риса шести различных видов рода Oryza были описаны [Chen et al., 2002]. Было показано, что межвидовое аллельное разнообразие проявляется в изменении количества повторов в SSR регионе, а частота InDel и замен оснований увеличивается с увеличением генетических расстояний между образцами [Chen et al., 2002]. Была изучена вариабельность SSR сиквинсов коллинеарных регионов ДНК indica и japonica. Только 25% SSR были консервативными в одинаковых локусах у indica и japonica риса. Большинство из идентифицированных SSR различались длинной повтора и имели одинаковые замены оснований в одинаковых локусах. Неудивительно, что каждая разновидность имеет свой уникальный набор SSR, отсутствующий у других. Интересно, что из 25 SSR, идентифицированных у образца 93-11 (indica), 15 SSR (60%) были идентичны с таковыми у других indica образцов и только 6 SSR были найдены у Nipponbare (japonica). Различия в характере SSR мотивов и длине повторов у indica и japonica образцов очевидны. Анализ сиквинсов нуклеотидных последовательностей показал, что эта разница связана в основном с заменами оснований или делециями [Li et al., 2004].
Неоднократно предпринимались попытки разделения образцов Oryza rufipogon на группы indica/japonica с использованием SSR маркеров. Li с соавторами [Li et al., 2006] провели изучение 19 диагностических indica/japonica SSR локусов 56 растений дикого риса (Oryza rufipogon) из естественной популяции. Только праймеры RM251 и RM18 могут амплифицировать несколько бэндов, остальные - только по одному дифференцирующему бэнду на каждый образец. 16 пар праймеров были идентичны таковым у культурных indica/japonica дифференцированных образцов Oryza sativa, включая 11 japonica-подобных и 4 indica-подобных локусов. RM18, RM202, RM205 были отличны от indica/japonica дифференцирующих бэндов культурных сортообразцов