Влияние красного пигмента дрожжей, продукта полимеризации аминоимидазол риботида, на амилоиды in vivo и in vitro

• Автор: Михайлова, Екатерина Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 145 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений Введение
Глава 1.Обзор литературы
1.1. Амилоидные агрегаты эукариотических организмов
1.2. Цитотоксичность амилоидных агрегатов
1.3. Дрожжи как модель для изучения амилоидов
1.3.1. Особенности образования и передачи прионов в клетках Saccharomyces cerevisiae
1.4. Противоамилоидная терапия Глава 2. Материалы и методы
2.1. Среды для культивирования микроорганизмов
2.2. Использованные штаммы и плазмиды
2.3. Генетические методы
2.4. Получение фракции осадочных белков из дрожжевых клеток
2.5. Электрофоретическое разделение белков
2.6. Выявление [Р57~]-фактора в осадочной фракции
2.7. Получение MALDI масс-спектров
2.8. Измерение интенсивности флуоресценции тиофлавина Т
2.9. Получение и анализ красного пигмента
2.10. Получение амилоидных фибрилл in vitro
2.11. Трансмиссионная электронная микроскопия
2.12. Методы статистической обработки Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Влияние красного пигмента на количество амилоидов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae
3.1.1. Уменьшение количества белковых агрегатов в

клетках при накоплении красного пигмента
3.1 .Сравнительная оценка количества амилоидов в
клетках дрожжей
3.1.3. Влияние присутствия красного пигмента на 75 стр. количество амилоидов в клетках дрожжей
3.1.4. Передача материала, характеризующегося высокими 85 стр. наследуемыми значениями ИФ, при цитодукции
3.2. Влияние красного пигмента на амилоиды in vitro
3.2.1. Получение чистого препарата красного пигмента
3.2.2. Влияние красного пигмента на формирование 90 стр. амилоидов in vitro.
3.3. Анализ пигмент-зависимых белков клеток Saccharomyces 99 стр. cerevisiae
Выводы
Библиографический список
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
В работе использована стандартная трехбуквенная номенклатура для обозначения генотипов и фенотипов дрожжей (Захаров и др., 1976) Применялись также следующие обозначения:
АИР - аминоимидазол риботид;
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;
ИФ - интенсивность флуоресценции;
ОИФ - относительная интенсивность флуоресценции;
ТФУ - трифторуксусная кислота;
УФ - ультрафиолетовое излучение;
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;
ЭФ - электрофорез;
CHAPS - 3-[(3-Холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфонат;
DTT - дитиотреитол;
GuHCl - гуанидин гидрохлорид;
HPR - пероксидаза хрена;
MALDI - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация;
PBS - натрий-фосфатный буфер;
PMSF - фенилметилсульфонилфторид;
PVDF - поливинилиденфторид;
SDS - лаурилсульфат натрия;
SDS-PAG - денатурирующий полиакриламидный гель;
SDS-PAGE - электрофорез в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях;
Tris - трис-(оксиметил)-аминометана (НОСНгДСМН
YEPD - полная среда (дрожжевой экстракт, пептон, глюкоза);
YEPD-ADE - полная среда, содержащая аденин в повышенной концентрации YEPE - полная среда с добавлением этанола вместо глюкозы;

В «жизненном цикле» [Р&Г] фактора Hspl04 участвует как на стадии конформационного перехода, так и на стадии фрагментации, поэтому для поддержания уровня этого приона в популяции необходим определенный уровень HspKM. Если шаперон отсутствует или инактивирован, частота конформационных переходов значительно снижается, если же его концентрация слишком высока, фрагментация протекает достаточно эффективно для того, чтобы полностью перевести белок в растворимую форму. Эта гипотеза позволила объяснить экспериментальные данные о том, что сверхэкспрессия и элиминация HSP104 приводят к одному эффекту -исчезновению [PSi4"] фенотипа (Chernoff et al., 1995). Похожим образом Hspl04 влияет на агрегацию в дрожжевых клетках PrP (Rubel et al., 2008), а также ß-амилоида (Bagriantsev and Liebman, 2006). Токсичность и агрегация гентингтина в трансгенных мышах с болезнью Гентингтона также уменьшаются при сверхэкспрессии Hspl04, что приводит к увеличению продолжительность жизни этих мышей по меньшей мере на 20 % (Vacher et al., 2005). Подобный результат может быть связан с изменением уровня конформационных переходов белка, со снижением уровня олигомеризации или агрегации, а также являться результатом нескольких независимых действий шаперона.
Шапероны семейства Hsp70 - белки Ssal и Ssa2 (Ssa 1/2), а также Ssbl и Ssb2 (Ssbl/2) участвуют в моделировании действия Hspl04. Так, белки Ssa 1/2 препятствуют элиминации [PS/] фактора (Newnam et al., 1999), а связанные с рибосомами Ssbl/2, наоборот, увеличивают вероятность потери прионового статуса (Allen et al., 2007) при сверхэкспрессии Hspl04. Кроме того, Ssbl/2 препятствуют образованию [PSi4] фактора de novo (Chernoff et al., 1999).
При взаимодействии с другими дрожжевыми прионами действие Hspl04 отличается: делеция HSP104 приводит к элиминации прионов URE3] и [PIN1], однако его сверхэкспрессия на уровень этих прионов никак не влияет, что