Стресс-реакции пресноводных амфипод в условиях гипертермии и при интоксикации ксенобиотиками

• Автор: Павличенко, Василий Валерьевич
• Шифр специальности: 03.02.08
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 164 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Стратегии адаптации организмов к стрессовым факторам
1.2 Ксенобиотики в водных экосистемах
1.2.1 Токсичность ксенобиотиков для гидробионтов
1.2.2 Воздействие тяжелых металлов на гидробионтов
1.2.3 Воздействие гуминовых веществ на гидробионтов
1.3 Температура как фактор среды
1.3.1 Воздействие температуры на гидробионтов
1.4 Ключевые механизмы клеточной стресс-резистентности
1.4.1 Система детоксикации ксенобиотиков. Механизм множественной резистентности к ксенобиотикам
1.4.1.1 Конъюгация с глутатионом
1.4.1.2 Роль АВС - транспортеров в механизме множественной резистентности к ксенобиотикам
1.4.1.3 Р-гликопротеин. Основные свойства, функции и механизм работы
1.4.1.4 МХЯ и Р-гликопротеин как биомаркер состояния водоёмов
1.4.2 Белки теплового шока (БТШ)
1.4.2.1 Классификация БТШ
1.4.2.2 Функции БТШ
1.4.2.3 Функциональная роль БТШ в защите гидробионтов от токсического воздействия
1.4.2.4 Функциональная роль БТШ в защите гидробионтов при температурном воздействии
1.5 Фауна Байкала как уникальный объект для экофизиологических исследований
1.5.1 Биоразнообразие, вопросы эволюции и явление несмешиваемости
1.5.2 История исследований механизмов адаптации к абиотическим факторам среды у эндемичных гидробионтов оз. Байкал
1.6 ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ. ПОСТАНОВКА ЦЕЛИ И ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
2 ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объект исследования
2.1.1 Систематика и экология изучаемых видов
2.1.2 Сравнительные уровни термо- и токсикорезистентности изучаемых видов
2.1.3 Методика сбора и содержания амфипод
2.2 МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
2.2.1 Эксперименты по оценке выводящей активности Р-гликопротеина у амфипод
2.2.2 Эксперименты по оценке воздействия хлорида кадмия на амфипод
2.2.3 Эксперименты по оценке воздействия препарата НБ1500 на амфипод
2.2.4 Эксперименты по оценке воздействия гипертермии на амфипод
2.3 МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
2.3.1 Определение содержания родамина С в тканях амфипод
2.3.2 Определение активности фермента глутатион Б-трансферазы
2.3.2.1 Подготовка образцов
2.3.2.2 Определение активности глутатион Б-транферазы
2.3.2.3 Определение концентрации общего белка по методу Бредфорд
2.3.3 Определение содержания белков теплового шока
2.3.3.1 Выделение общего белка
2.3.3.2 Определение концентрации общего белка по методу Лоури
2.3.3.3 Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.3.3.4 Иммуноблоттинг
2.4 МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА
2.4.1 Выделение общей РНК, очистка мРНК. Обратная транскрипция
2.4.2 Определение нуклеотидной последовательности генов бтш70, Рр и 0-актина
2.4.2.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.4.2.2 Очистка ПЦР продукта из агарозного геля

2.4.2.3 Клонирование ПЦР продукта в клетках E
2.4.2.4 Подготовка плазмид для секвенирования
2.4.2.5 Секвенирование и анализ полученных нуклеотидных последовательностей генов
2.4.2.6 Быстрая амплификация концов кДНК (RACE)
2.4.3 Количественная ПЦР в реальном времени(кПЦР)
2.5 Расчет и статистическая обработка данных
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Изменение выводящей активности Р-гликопротеина у байкальских и палеарктических амфипод в условиях воздействия стрессовых факторов
3.1.1 Изменение выводящей активности Р-гликопротеина у амфипод, экспонированных при температуре 25°С
3.1.2 Изменение выводящей активности Р-гликопротеина у амфипод, экспонированных в растворах CdCl2
3.1.3 Изменение выводящей активности Р-гликопротеина у амфипод, экспонированных в растворах
HS1500
3.2 Изменение активности глутатион S-трансферазы у амфипод вида G. lacustris в условиях воздействия стрессовых факторов
3.2.1 Изменение активности глутатион S-трансферазы у амфипод вида G. lacustris, экспонированных при температуре 25°С
3.2.2 Изменение активности глутатион S-трансферазы у амфипод вида G. lacustris, экспонированных в растворах CdCl2
3.2.3 Изменение активности глутатион S-трансферазы у амфипод вида G. lacustris, экспонированных в растворах HS1500
3.3 Изменение содержания белков теплового шока семейства БТШ70 у байкальских и палеарктических амфипод в условиях воздействия стрессовых факторов
3.3.1 Изменение содержания белков теплового шока семейства БТШ70 у амфипод, экспонированных при температуре 25°С
3.3.2 Изменение содержания белков теплового шока семейства БТШ70 у амфипод, экспонированных в растворах CdCl2
3.3.3 Изменение содержания белков теплового шока семейства БТШ70 у амфипод, экспонированных в растворах HS1500
3.4 Изменение экспрессии генов бтш70 у байкальских и палеарктических амфипод в условиях воздействия стрессовых факторов
3.4.1 Изменение экспрессии генов бтш70 у амфипод, экспонированных при температуре 25°С
3.4.2 Изменение экспрессии генов бтш70 у амфипод, экспонированных в растворах CdCl2
3.4.3 Изменение экспрессии генов бтш70 у амфипод, экспонированных в растворах HS1500
3.5 Изменение экспрессии генаP-gp у палеарктического G. lacustris в условиях воздействия стрессовых факторов
3.5.1 Изменение экспрессии гена P-gp у амфипод вида G. lacustris, экспонированных при температуре 25°С
3.5.2 Изменение экспрессии гена P-gp у амфипод вида G. lacustris, экспонированных в растворах CdCI2
3.5.3 Изменение экспрессии гена P-gp у амфипод вида G. lacustris, экспонированных в растворах HS1500
3.6 Общее обсуждение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
БТШ - белки теплового шока ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота кД НК - комплиментарная ДНК
кат - катал - единица измерения активности ферментов. 1 катал соответствует такому количеству фермента, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с. кДа - килодальтон (103 атомных единиц массы) л
мг - миллиграммы (НЕ3 г)
мкг - микрограммы (НЕ6 г)
нкат - нанокатал (109 катал)
ч. - часы (при обозначении времени экспозиции)
Рр - Р-гликопротеин
ПЦР - полимеразная цепная реакция
кПЦР - количественная ПЦР в реальном времени
ГВ - гуминовое вещество
РОУ - растворенный органический углерод
ЛК50 - средняя летальная концентрация
НБ1500 - низкомолекулярное синтетическое гуминовое вещество со средней молекулярной массой 1,5 кДа.
МХИ - множественная резистентность к ксенобиотикам (от анг. МиШхепоЫойс Ввгаше)

Smital, 1998), однако его активизация до уровня моллюсков из загрязнённых водоёмов индуцируется трёхдневным экспонированием в загрязнённой среде (Kurelec, 1995d; Smital, 1998). У устриц Crassostrea virginica из загрязнённых водоёмов обнаружено повышенное содержание Р-гликопротеина (Keppler, 2011). Влияние содержания ксенобиотиков в среде на активность механизма MXR выявлено у моллюсков Corbicula fluminea (Achard, 2004; Kurelec, 1996a), Mytilus californianus (Eufemia, 2000), M. edulis (Bard, 2000), Dreissena polymorpha (Pain and Parant, 2007), ракообразного Paleomonetes pngio (Bard, 2000; Scott, 1999), у рыб Anoplarchus piirpurescens и Fundulus heteroclitus (Bard, 1999; Cooper, 1999; Bard, 2000), а также у других гидробионтов (Bard, 2000). Выявлено влияние интоксикации хлоридом кадмия на активность механизма MXR у байкальских амфипод Eulimnogammarus cyaneus (Тимофеев, 2010).
Эти данные говорят о возможности оценки уровня загрязнения водоёмов по степени активизации различных компонентов системы MXR у гидробионтов. Это может оказаться особо актуальным при оценке загрязнения различных областей озера Байкал. Несмотря на широкий интерес исследователей по всему миру к вопросу изучения механизма множественной резистентности к ксенобиотикам у водных организмов, в отечественной науке подобные исследования до сих пор не проводились. Следует отметить, что для озера Байкал исследования в данной области носят единичный характер и проводятся только группой под руководством Тимофеева М.А. (Pavlichenko, 2011; Тимофеев, 2010; Тимофеев, 2008; Шаталина, 2007; Timofeyev, 2007).
1.4.2 Белки теплового шока (БТШ)
Стресс-реакция организмов на клеточном уровне также включает в себя синтез специализированных белков - белков теплового шока (БТШ). Изначально Ф. Ритоззой были открыты гены, кодирующие БТШ, при изучении политенных хромосом слюнных желез личинок дрозофилы в 1962 году (Ritossa, 1962). В 1974 году были идентифицированы белки, кодируемые этими генами, когда в ответ на повышение температуры среды у личинок дрозофилы