Разработка методических подходов к генотипированию штаммов чумного микроба

• Автор: Гаева, Анна Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 173 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 .Методы генотипирования бактерий
1 .Идентификация и генотипирование патогенных иерсиний
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 .Бактериальные штаммы
2.2.Питательные среды, препараты и реактивы
2.3.Методы исследований
2.3.1. Бактериологические методы
2.3.2. Генетические методы
2.3.3. Методы статистической обработки материала
ГЛАВА 3. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ
ЧУМНОГО И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБОВ ПО ПРИЗНАКАМ, СВЯЗАННЫМ С ВИРУЛЕНТНОСТЬЮ
ГЛАВА 4. ТИПИРОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ МЕТОДОМ
ВЫЧИТАЮЩЕГО РЕСТРИКЦИОННОГО ФИНГЕРПРИНТИНГА
4.1. Выбор потенциальных пар эндонуклеаз рестрикции для 73 вычитающего рестрикционного фингерпринтинга патогенных иерсиний
4.2. Изучение дискриминирующих возможностей метода вычитающего 75 рестрикционного фингерпринтинга при использовании ЕсоШ
пары эндонуклеаз рестрикции
4.3. Паспортизация штаммов чумного микроба различного 78 происхождения на основе вычитающих рестрикционных фингерпринтов
4.4. Компьютерный анализ данных вычитающего рестрикционного 82 фингерпринтинга штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов ГЛАВА 5. ТИПИРОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ НА ОСНОВЕ
ЧЕТЫРЕХ VNTR ЛОКУСОВ
5.1. Поиск новых вариабельных областей генома чумного микроба
5.2. ПЦР - VNTR анализ штаммов чумного микроба разного происхождения и вирулентных штаммов псевдотуберкулезного микроба
5.2.1. Изучение вариабельности I VNTR области у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов
5.2.2. Изучение вариабельности IIVNTR области у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов
5.2.3. Изучение вариабельности III VNTR области у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов
5.3. Определение сиквенс типов вариабельных областей штаммов чумного микроба разного происхождения
5.4. Сиквенс типы вариабельных областей вирулентных штаммов псевдотуберкулезного микроба
ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ИДЕНТИФИКАЦИИ И ВНУТРИВИДОВОГО VNTR ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА
6.1. Условия проведения ПЦР с праймерами TAN 1-Т AN 2 и подбор гелей для разделения продуктов амплификации
6.2. Создание маркеров на основе фрагментов ДНК, полученных с ДНК референтных штаммов чумного микроба разного происхождения
6.3. Учет и интерпретация результатов ПЦР анализа
ГЛАВА 7. СРАВНЕНИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И ГЕНОТИПИЧЕСКИХ СХЕМ КЛАССИФИКАЦИИ ЧУМНОГО МИКРОБА ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВРФ - вычитающий рестрикционный фингерпринтинг
кДа - кило дальтон
КОЕ - колониеобразующая единица
Мда - мегадальтон
м.к. - микробная клетка
н.о. — не определялось
ПЦР - полимеразная цепная реакция
п.н. - пара нуклеотидов
т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат Na
BLAST - Basic Local Alignment Searching Tool
dNTP- дезоксинуклеотидтрифосфат (deoxynucleotidtriphosphate)
Hms - признак пигментации (hemin storage)
hms - оперон, отвечающий за сорбцию гемина
MLST- мультилокусное секвенирование (multilocus sequence typing)
MLVA - мультилокусный VNTR анализ (multilocus VNTR analysis)
MST - мультиспейсерное сиквенс типирование (multispacer sequence typing) pgm - область пигментации хромосомы ('pigmentation locus)
A pgm - делеция области пигментации
PFGE - электрофорез в пульсирующем поле (pulsed-field gel electrophoresis)
Psn - чувствительность штамма к действию пестицина (pesticin sensitivity)
Pst - признак продукции пестицина (pesticin production) pst - структурный ген, кодирующий синтез пестицина IVN - аллель I VNTR области IIVN - аллель IIVNTR области IIIVN - аллель III VNTR области
VNTR - область с вариабельным числом тандемных повторов (various number tandernrepeat)

присутствие генов, специфических для возбудителя чумы и связанных с экспрессией вирулентности. Чаще всего используют праймеры для выявления видоспецифических генов cafi, pla, lcrY,yop, pst. Их продукты специфичны для чумного микроба и использовались ранее при исследовании микробиологическими и серологическими тестами.
Для поиска уникальных последовательностей ДНК перспективным является метод супрессорной субтрактивной гибридизации, который может быть использован для высокоспецифичной идентификации бактерий. A.N. Iwobi с соавт. (2003) применили данный метод для картирования уникального участка ДНК, характерного для группы вида Y enterocolitica, высокопатогенной и летальной для мышей. Была открыта новая инсерционная последовательность IS1330, представленная только в патогенных серотипах Y. enterocolitica и сделано предположение о возможности использования IS1330 для эпидемиологического типирования [93]. Исследованиями A. Rakin с соавт. (2003) в Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis идентифицированы последовательности с высокой степенью гомологии к генам, кодирующим токсины Vcholerae, Xenorhabdus bovientii. Авторы указывают, что метод оказался эффективным в выявлении роли геномных отличий в патогенезе инфекций, обусловленных клинически важными иерсиниями. Так, используя супрессорную субтрактивную гибридизацию, выявлен специфический для Y.pestis регион размером 41,7 т.п.н., идентифицировано шесть регионов (different region, DFR), варьирующих между штаммами Y.pestis и которые, по мнению авторов, могут быть использованы в получении профилей для дифференциации этого возбудителя [131, 132]. Y. Li с соавт. в 2008 году провели генетическое типирование, основанное на DFR регионах, 912 штаммов чумного микроба, выделенных в Китае. Штаммы показали биовар-специфические DFR профили, причем результаты исследования хорошо согласовались с данными, полученными другими методами типирования