Использование микробных биосенсоров для анализа углеводов, ксенобиотиков и параметров состояния окружающей среды

• Автор: Ильясов, Павел Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Содержание
Содержание
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цель и задачи исследования
1.3. Научная новизна работы
1.4. Практическая значимость работы
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Общие сведения о микробных сенсорах
2.2. Используемые типы преобразователей
2.3. Строение биорецептора
2.4. Микробные биосенсоры и нанотехнологии
2.5. Методы повышения селективности анализа
2.6. Практическое использование микробных сенсоров
2.6.1. Детекция углеводов
2.6.2. Анализ спиртов и органических кислот
2.6.3. Определение антибиотиков
2.6.4. Детекция аминокислот, холестерина и других соединений, не представляющих
опасности с точки зрения окружающей среды
2.6.5. Использование микробных биосенсоров в природоохранных целях - общие
аспекты
2.6.6. Определение ароматических соединений
2.6.7. Определение ионов неорганических кислот и тяжелых металлов
2.6.8. Анализ других экологически опасных соединений
2.6.9. Определение общей токсичности и генотоксичности
2.6.10. Биосенсорное определение БПК
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Регистрация сигналов
3.2. Особенности использованных в работе штаммов. Культивирование клеток
3.3. Иммобилизация микроорганизмов
3.4. Гипероксигенация измерительного раствора
3.5. Обработка данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Сенсор для определения углеводов на основе С. оху<1ат

4.1.1. Скрининг штаммов рода аисопоЬаег
4.1.2. Исследование влияния концентрации растворенного кислорода на сигналы
амперометрического биосенсора
4.1.3. Использование сенсора на основе (7. охус1ат для анализа глюкозы в сыворотке
крови человека
4.1.4. Оценка содержания глюкозы в ферментационной среде
4.2. Микробный биосенсор для детекции анионных ПАВ
4.2.1. Скрининг штаммов и общие характеристики моделей
4.2.2. Оценка оптимального метода иммобилизации
4.2.3. Оценка возможности качественного анализа проб сложного состава
4.2.4. Тестирование моделей сенсоров на образцах модельных и реальных сточных вод
4.3. Детекция нафталина
4.4. Детекция ионов нитрита
4.5. Создание БПК-сенсора на основе клеток Агхи1а ас1етпоюгат и оценка его
характеристик
4.5.1. Проведение испытаний анализаторов на модельных и реальных образцах
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность проблемы.
Последнее десятилетие отмечено интенсивным изучением аналитических возможностей и практическим применением биосенсорных систем. Потребности медицинской диагностики, различных областей биотехнологии, промышленности, природоохранных служб ставят перед аналитической химией комплекс задач, связанных с разработкой простых в применении, недорогих, высокочувствительных и специфичных методов и приборов на их основе для обнаружения заданных веществ в образце. Одновременное следование указанным требованиям достаточно проблематично. Вместе с тем многие из перечисленных условий воплощаются в биосенсорах, совмещающих идеи и достижения современной биологии, электронных технологий и химических наук.
Принцип детекции, реализованный в биосенсорах, основан на том, что биоматериал (ферменты, клетки, антитела и др.), иммобилизованный на физическом датчике (преобразователе) электрохимического, оптического или иного типа, при взаимодействии с определяемым соединением генерирует зависимый от его концентрации сигнал, который регистрируется преобразователем и после обработки данных представляется в численном виде. Простота устройства, оперативность, специфичность и низкая стоимость биосен-сорного анализа создают развитию этой области аналитической биотехнологии высокую степень приоритета.
Использование микроорганизмов в качестве основы биосенсоров является достаточно известным подходом. В ряде работ показано, что микробные биосенсоры могут быть эффективно использованы для анализа широкого спектра соединений при биотехнологических процессах и экологическом мониторинге. Важными моментами, указывающими на перспективность микробных биосенсоров, является многообразие ферментативного аппарата микробных клеток, что открывает возможность подбора микроорганизмов для анализа практически любого соединения, а также тот факт, что ферменты внутри клеток находятся в "эволюционно оптимизированных условиях" - это в ряде случаев приводит к повышению стабильности аналитических сигналов. Немаловажным с практической точки зрения фактором является более низкая стоимость микробных биосенсоров по сравнению с ферментными ввиду отсутствия необходимости очистки ферментов и использования кофакторов. Перечисленные факты обуславливают акту-

управлением общего промотора, либо штаммов, чувствительных к токсическому действию металлов (по аналогии с сенсорами токсичности); этот подход используется для обнаружения ионов мышьяка, ртути, кадмия, меди, никеля, свинца и других металлов [240-249]. В качестве конкретного примера можно привести биолюминесцентный сенсор на основе рекомбинантного штамма Е. соН для определения токсичности соединений мышьяка. Нижний предел детекции 0.01 мкг/л в пересчете на чистый мышьяк. Отмечено повышение величины ответов при лимитировании бактерий по фосфату [85].
Микробный сенсор для детекции цианида был основан на использовании клеток б1, сегетшае и кислородного электрода. Принцип детекции - регистрация снижения ответа на глюкозу в присутствии цианида (т.е. данный сенсор использовал подход, характерный для сенсоров токсичности). Диапазон линейной детекции составил 0.3-150 мкМ. [250]
Электрохимические биосенсоры для детекции нитрита основаны главным образом на использовании нитритредуктазы и медиаторов электронного транспорта; как правило, они характеризуются высокой чувствительностью и селективностью [251-253], но требуют наличия высокоочшценных ферментов, что повышает стоимость анализа. В то же время, описаны модели микробных биосенсоров для детекции нитрита на основе использования бактерий, относящихся к родам Рагасоссш и ШгоЬаШг [39, 254]. Так, микробный биосенсор для детекции нитрита, представленный в работе [39], был основан на использовании штамма МтоЬас1ег Бр., выделенного из активного ила очистных сооружений пищевого комбината. Конструкция ячейки характеризовалась усложненностью и включала две камеры, разделенные газопроницаемой мембраной; существенное неудобство при работе с данным сенсором также заключалось в медленном росте микроорганизмов (для наработки необходимого количества биомассы требовалось порядка 7 месяцев). Линейный диапазон калибровки данной модели располагался в области концентраций до 0.59 мМ, нижний предел детекции составлял 10 мкМ (отношение сигнал/шум 20, воспроизводимость 5%). Общая воспроизводимость ответов сенсора составила 4%. Температурный оптимум был равен 30° С, рН-оптимум - 2 единицы pH. Сенсор был стабилен свыше 21 сут (400 измерений, практически постоянный уровень аналитического сигнала). Время ответа занимало 25 мин. Коэффициент корреляции показаний с альтернативным методом (колориметрическое определение нитрита по БаИгтап) составил 0.99.
Аналогичный микробный сенсор был сконструирован для анализа газообразного N02 на основе нитритокисляющих бактерий, выделенных из активного ила очистных со-