Качественный и количественный состав тритерпеновых гликозидов культур клеток in vitro представителей семейства Araliaceae : на примере Panax spp. и Polyscias spp.

• Автор: Кочкин, Дмитрий Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Ботаническая характеристика растений рода женьшень (Panax L.)
1.2. Ботаническая характеристика растений рода полисциас {Polyscias
J. R. Forst. & G. Forst.)
1.3. Тритерпеновые гликозиды растений рода женьшень {Panax L.)
1.4. Количественный и качественный состав и функции три-
терпеновых гликозидов в интактных растениях женьшеня
1.5. Тритерпеновые гликозиды растений рода полисциас {Polyscias J.
R. Forst. & G. Forst.)
1.6. Малонил-гликозиды: многообразие и функции
1.7. Культуры клеток и тканей женьшеня и полисциаса
1.7.1. Получение культур клеток и тканей женьшеня
1.7.2. Физиологические характеристики культур клеток
женьшеня
1.7.3. Тритерпеновые гликозиды и другие биологически
активные вещества женьшеня в культуре in vitro
1.7.4. Глубинное выращивание суспензионных культур клеток представителей рода Рапах
1.7.5. Культуры клеток и тканей полисциаса
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объекты
2.2. Методы выращивания культур клеток
2.3. Исследование ростовых характеристик культур клеток
2.4. Методы фитохимического анализа тритерпеновых гликозидов
2.5. Выделение и установление структуры тритерпеновых гликозидов
2. 5.1. Выделение тритерпеновых гликозидов из листьев
Poly scias filicifolia
2. 5.2. Выделение тритерпеновых гликозидов из культуры
клеток Рапах japonicus var. repens
2. 5.3. Установление структуры выделенных гликозидов
2.6. Количественный анализ тритерпеновых гликозидов
2. 6.1. Подготовка проб и условия проведения ВЭЖХ анализа
2. 6.2. Проверка описанных методов ВЭЖХ анализа
2.7. Обработка данных и представление результатов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Тритерпеновые гликозиды культур клеток Poly scias spp
3.2. Изменение содержания тритерпеновых гликозидов в цикле
выращивания культуры клеток P. fruticosa
3.3. Тритерпеновые гликозиды культур клеток женьшеня Рапах spp
3.4. Изменение содержания гинзенозидов в цикле выращивания
культуры клеток P. japonicus var. repens в колбах
3.5. Изменение содержания гинзенозидов в цикле выращивания
культуры клеток P. japonicus var. repens в биореакторе
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Своеобразие вторичного метаболизма растений семейства Аралиевых заключается в образовании значительных количеств тритерпеновых гликозидов различной структуры (Еляков, Оводов, 1972; Журавлев, Коляда, 1996). В настоящее время эти соединения обнаружены у представителей 24 родов Araliaceae (Гришковец, 2004), что составляет около трети от общего числа родов семейства. В качестве агликонов гликозидов аралиевых выступают тритерпеноиды более десяти различных структурных типов (Vincken et al., 2007; Dinda et al., 2010), однако наибольший интерес представляют две основные группы соединений — производные пентациклического тритерпеноида /i-амирина и тетрациклического тритерпеноида П-даммарендиола. Важно, что гликозиды с агликонами этих типов неравномерно распределены среди растений семейства (Christensen, 2008): производные /?-амирина обнаружены у всех исследованных аралиевых, тогда как гликозиды с агликонами даммаранового ряда встречаются, за редкими исключениями, только в различных видах женьшеня (род Рапах L.).
Систематическое исследование химического состава представителей Araliaceae было начато более полувека назад. За прошедшее время показано, что в каждом изученном объекте тритерпеновые гликозиды представлены в виде сложных смесей, структурное многообразие компонентов которых поражает воображение исследователей. Ярким примером этого являются результаты изучения рода Рапах spp., из различных видов которого в настоящее время выделено более 300 индивидуальных гликозидов (Qi et al., 201 la).
Работы по получению и исследованию культур клеток растений семейства Araliaceae стартовали одновременно с первыми успехами выяснения полной структуры тритерпеновых гликозидов аралиевых. Первые каллусные и суспензионные культуры клеток ряда видов Рапах spp. и Polyscias spp. были получены в середине прошлого столетия (Бутенко, 1964; Слепян и др., 1975а,б). К настоящему времени получены десятки культур клеток видов семейства. В то же время, исследования тритерпеновых гликозидов в полученных культурах, как

правило, носят схематичный характер и сводятся к качественному и количественному анализу только тех компонентов, для которых доступны коммерческие стандартные образцы. Например, для культур клеток и тканей различных видов женьшеня обычно определяют содержание семи нейтральных гинзенозидов (Rgi, Re, Rf, Rbb Rc, Rb2, Rd) — основных тритерпеновых гликозидов корня женьшеня настоящего (Wu, Zhong, 1999). Очевидно, что результаты подобных исследований не дают представления о возможности образования в клетках in vitro сложного паттерна тритерпеновых гликозидов, характерного для растений семейства Araliaceae in vivo.
Таким образом, можно заключить, что детальное изучение путей формирования и особенностей многообразия тритерпеновых гликозидов в культурах клеток и тканей аралиевых является весьма актуальной задачей.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы: изучить особенности качественного и
количественного состава тритерпеновых гликозидов в культурах клеток представителей семейства Araliaceae (на примере Panax spp. и Polyscias spp.) и выяснить закономерности его изменения в процессе роста клеток in vitro.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести фитохимический анализ культур клеток двух видов полисциаса {Polyscias ßlicifolia, P. fruticosa) и двух видов женьшеня (Panax japonicus var. repens и P. ginseng);
2. Провести препаративное выделение и структурную идентификацию основных тритерпеновых гликозидов культур клеток Polyscias spp. и Panax japonicus var. repens;
3. Изучить изменение качественного и количественного состава тритерпеновых гликозидов в процессе выращивания исследуемых культур клеток.

питательную среду, клетки начинают делиться и к 3-им суткам доля делящихся клеток достигает 6,5%. На 6-7 сутки культивирования происходит резкое снижение митотического индекса до 2-3% и этот уровень сохраняется с некоторыми колебаниями в течение последующих 10-12 суток культивирования. К 21-м суткам выращивания митотический индекс снижается до 0,5% (Смоленская и др., 2005; 2007; Smolenskaya et al., 2007).
1.7.3. Тритерпеновые гликозиды и другие биологически активные вещества женьшеня в культуре in vitro
На сегодняшний день большой интерес для исследователей представляет
изучение связи ростовых параметров культуры клеток женьшеня с их биосинтетическими возможностями. Так, в работе Н. А. Константиновой с коллегами показано, что накопление гинзенозидов в течение одного цикла роста каллусной культуры женьшеня носит колебательный характер и описывается кривой с двумя-тремя вершинами. Кроме того, обнаружена обратная связь между активностью гликозидаз и содержанием гинзенозидов в клетках (Константинова и др., 1995). При исследовании достаточно большого количества каллусных линий Р. ginseng В. Г1. Булгаков с сотрудниками установили, что биосинтез гинзенозидов протекает одинаково во всех каллусах и не зависит от сорта, популяции или органа растений женьшеня, из которых были получены каллусы (Булгаков и др., 1991). В этой же работе показано, что трансформация клеток женьшеня плазмидами агробактерий Agrobacterium rhizogenes приводит к увеличению содержания в них гинзенозидов. Механизм этого эффекта пока не известен, однако известно, что трансформация геном то/В из A. rhizogenes клеток женьшеня приводит к увеличению экспрессии семейства генов CDPK (Calcium-Dependent Protein Kinase), вероятно, за счёт изменения активности кальциевых каналов (Киселёв и др., 2007).
Группой китайских учёных под руководством J. J. Zhong была выполнена целая серия работ, посвящённых оптимизации концентрации таких веществ как: сахароза, нитраты калия и аммония, фосфаты и фитогормоны, в среде выращивания с учётом изменения ростовых параметров и содержания суммы