Получение растений сахарной свеклы и капусты белокочанной с устойчивостью к микробным патогенам

• Автор: Пиголева, Светлана Васильевна
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 148 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Влияние стрессовых факторов внешней среды на морфогенез растений и способы их защиты
1.1.1. Окислительный стресс и система защиты растений
1.1.2. Влияние антропогенных факторов
1.1.3. Воздействие абиотических факторов
1.1.4. Действие биотических факторов среды
1.1.4.1. Влияние фитопатогенных грибов на растения
1.1.4.2. Влияние фитопатогенных бактерий на растения
1.1.4.3. Влияние вирусов на растения
1.1.4.4. Влияние фитопаразитов и насекомых на растения
1.2. Болезни сахарной свеклы и капусты белокочанной
1.3. Методы защиты растений от патогенов и вредителей
1.3.1. Химические методы защиты растений
1.3.2. Биологические методы защиты растений
1.4. Колонизация растений ассоциативными микроорганизмами
1.4.1. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, механизмы их положительного влияния на растения
1.4.2. Факторы, влияющие на колонизацию Pseudomonas
ризосферы растений
1.4.3. Использование бактерий рода Pseudomonas для защиты растений от фитопатогенов
1.4.4. Аэробные метилотрофные бактерии рода Methylobacterium
1.4.5. Перспективы использования метилотрофных бактерий
1.5. Совершенствование сортов сельскохозяйственных растений методами генной инженерии

1.5.1. Методы трансформации растений
1.5.1.1. Методы прямого переноса ДНК в растения
1.5.1.2. Методы агробактериальной трансформации растений
1.5.2. Использование генов антибактериальных пептидов для получения транс генных растений
1.5.2.1. Использование генов цекропинов для повышения устойчивости трансгенных растений к фитопатогенам
1.5.3. Генетическая инженерия и биотехнология сахарной свеклы
1.5.4. Генетическая инженерия и биотехнология капусты белокочанной
1.5.5. Актуальность получения безмаркерных трансгенных
растений
2. Материалы и методы
2.1. Материалы и оборудование
2.1.1. Растительный материал
2.1.1.1. Характеристика биологических объектов
2.1.2. Бактериальные штаммы
2.1.3. Оборудование
2.1.4. Реактивы, среды, антибиотики
2.2. Методы
2.2.1. Культивирование растений in vitro
2.2.2. Регенерация побегов растений
2.2.3. Агробактериальная трансформация сахарной свеклы
и капусты белокочанной
2.2.4. Выделение геномной ДНК из листьев растений in vivo
2.2.5. Выделение ДНК из растений in vitro для ПЦР
2.2.6. Анализ геномной ДНК трансгенных растений методом ПЦР
2.2.7. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле
2.2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.9. Приготовление компетентных клеток E. coli и их

трансформация плазмидной ДНК
2.2.10. Приготовление компетентных клеток Agrobacterium Ште/аЫет и их трансформация плазмидной ДНК
2.2.11. Вестерн-блот анализ
2.2.12. Анализ антибиотической активности экстрактов трансформированных растений
2.2.13. Колонизация растений ассоциативными микроорганизмами
2.2.14. Биотесты на изолированных листьях и целых растениях
2.2.15. Измерение переменной флуоресценции хлорофилла
2.2.16.Тестирование антибиотической активности
метилобактерий к эрвиниям
2.2.17. Выделение ферментов-антиоксидантов из растительных
клеток
2.2.18. Определение активности супероксиддисмутазы в
экстрактах растительных клеток
2.2.19. Определение активности каталазы в экстрактах растительных клеток
2.2.20. Определение активности гвояколовой пероксидазы
2.2.21. Определение перекисного окисления липидов
2.2.22. Определение перекиси водорода в клетках растений
2.2.23. Определение содержания свободного пролина
3. Результаты и обсуждение
3.1. Разработка методов микроклонального размножения растений
3.1.1. Микроклональное размножение сахарной свеклы
3.1.1.2. Регенерация побегов сахарной свеклы через промежуточную каллусную фазу
3.1.2. Микроклональное размножение капусты белокочанной
3.2. Агробактериальная трансформация растений
3.2.1. Оценка чувствительности капусты к канамицину
3.2.2. Оценка чувствительности сахарной свеклы к канамицину

ton., 1982; Barker et al., 1983; Barry et al., 1984; Бурьянов, Кадо, 1989; Kado, 1991; Gelvin, 2003; Пермякова и др., 2009).
Несмотря на эффективность метода и значительные результаты, полученные при его использовании, агробактериальная система трансформации имеет определенные ограничения, связанные с избирательной вирулентностью агробактерий по отношению к виду и генотипу растения. Не все растительные клетки в заданных условиях компетентны для интеграции чужеродных генов. Компетентность клеток для генетической трансформации и регенерации детерминируется рядом параметров: видовой принадлежностью, индивидуальным генотипом, стадией развития растения, типом органа, ткани и условиями выращивания. Проникновение чужеродной ДНК в растительную клетку не всегда сопровождается стабильной интеграцией этой ДНК в растительный геном.
Некоторые из упомянутых проблем можно решить, используя другие методы введения чужеродной ДНК в клетки растений, такие как баллистическая трансформация, электропорация, трансфекция и другие (Walter et al., 1998; Ivic-Haymes a. Smigocki, 2005). Все эти методы отличаются способом введения чужеродной информации в клетку, тем не менее, требуют обязательной регенерации побегов и полноценных растений из трансформированных клеток.
Разработка методов регенерации растений из различных соматических тканей представляет самостоятельную задачу исследований. До сих пор отсутствует детальное представление о молекулярно-генетических механизмах адвентивной регенерации побегов. В связи с этим, разработка протоколов регенерации до настоящего времени сводится, в основном, к поиску генотипов с высоким регенерационным потенциалом и эмпирическому подбору состава сред.