Регуляция транскрипции цитокинин-связывающим белком 70 кД кукурузы

• Автор: Бровко, Федор Александрович
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 156 с. : 40 ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список используемых сокращений
Введение
Глава 1 Обзор литературы.
1. Гормоны растений и методы исследования передачи гормонального сигнала.
1.1. Цитокинины. Активность, биосинтез и метаболизм
1.2. Молекулярные механизмы рецепции и передачи цитокининового сигнала в растении.
1.3. Передача гормонального сигнала в клетках животных.
1.3.1. «Ядерные рецепторы».
1.3.2. Мембранные рецепторы эстрогенов
1.3.3. Рецепторы стероидных гормонов митохиндриальной локализации.
1.4. Клеточная сигнализация у прокариот.
1.5. Молекулярные механизмы рецепции цитокининов в растении.
1.5.1. Мембранные рецепторы цитокининов. Основные положения.
1.5.2. Белки бикомпонентной регуляторной системы, задействованные в передаче цитокининового сигнала.
I.5.2.1. Белки - переносчики фосфатной группы в гистидиновой протеинкиназной сигнальной системе — фосфотрансмиттерные белки (АИР).
1.5.2.2. Белки регуляторы ответа.
1.5.2.3. Характеристика регуляторов ответа А-типа.
1.5.2.4. Характеристика регуляторов ответа В-типа.
1.5.2.5. Цитокинин-индуцируемые транскрипционные факторы арабидопсис.
I.5.2.6. Особенности функционирования двукомпоиентной рецепторной сигнальной системы.
1.6.1. Внутриклеточные рецепторы цитокининов.
1.6.2. Цитокинин-зависимый регулятор транскрипции хлоропластов.

Глава 2 Материалы и методы исследования.
Г лава 3 Результаты и их обсуждение
3.1. Выделение и характеристика ЦСБ70.
3.1.1. Метод 1. Выделения ЦСБ70 из этиолированных проростков кукурузы с отделением вторичных метаболитов хроматографией на основе гидрофобных взаимодействий, на ТоуореаН Н¥60.
3.1.2. Метод 2. Разделение белков и "фенолов" растительного экстракта фракционированием СА в присутствии небольших концентраций полиэтиленгликоля (ПЭГ).
3.1.3. Первая схема выделения ЦСБ
3.1.4. Применение аффинной хроматографии на иммобилизованном лиганде для выделения ЦСБ70.
1.3.5. Вторая группа методов выделения ЦСБ70
3.1.6. Третья схема выделения ЦСБ.
3.2. Определение цитокинин-связывающей активности белка
3.3. Функциональная характеристика ЦСБ. Особенности взаимодействия с гормонами растений.
3.4. Регуляция ЦСБ70 транскрипции. Анализ реакции и ее зависимость от ЦСБ70 и зеатина.
3.5. Иммунохимические исследования ЦСБ70.
3.5.1. Получение моноклональных антител к ЦСБ70.
3.5.2. Эпитопный анализ ЦСБ70
3.5.3. Влияние гормона на взаимодействие ЦСБ70 с антителами.
3.5.4. Разработка тест-системы для анализа ЦСБ70 на основе сандвич-варианта ИФА в сочетании с стрсптавидин-биотиновой системой.
3.5.5. Регуляция ЦСБ70 транскрипции. Анализ влияния антител кЦСБ70 на активацию элонгации транскрипции белком.
3.5.6. 1 Иммунохимический анализ ЦСБ70 подобных белков в злаках
3.5.7. Исследование локализации ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения корня.
3.5.8. Локализация ЦСБ70 в этиолированном проростке кукурузы

35.9 Изучение содержания ЦСБ70 в различных органах проростка в процессе его роста.
3.5.10. Анализ содержания цитокининов в кончике корня проростка кукурузы
3.5.11 Анализ содержания ЦСБ70 в тканях растения кукурузы иммуноблотингом.
3.6. Иммуноцитохимические исследования ЦСБ70
3.6.1. Подбор условий для иммунохимического исследования ЦСБ70. Анализ применимости антител для изучения локализации ЦСБ70 в клетках растения кукурузы.
3.6.2. Анализ специфичности и способности антител узнавать ЦСБ70 на срезах.
3.7. Изучение внутриклеточной локализации ЦСБ70 в этиолированных проростках кукурузы иммуноцитохимическими методами.
3.7.1. Анализ локализации ЦСБ70 в клетках с помощью антител первой группы.
3.7.2. Исследование локализации ЦСБ70 в клетках меристемы кончика корня и листа методами электронной микроскопии с помощью антител к ЦСБ70 первой группы и коньюгата стрептавидин-золото.
3.8. Изучение локализации ЦСБ70 в пластидах проростков кукурузы иммуноцитохимическими методами с использованием МА второй группы.
3.8.1. Изучение локализации ЦСБ70 в амилопластах.
3.8.2. Анализ локализации ЦСБ70 в этиопластах и хлоропластах с помощью антител второй группы. Исследование методами световой микроскопии
3.8.3. Исследование локализации ЦСБ70 в этиопластах и хлоропластах с помощью антител второй группы методами электронной микроскопии.
3.8.4. Изучение локализации ЦСБ70 в хлоропластах зеленых листьев кукурузы.
3.9. ЦСБ70 как регулятор элонгации транскрипции в пластидах.
3.9.1. Активация с помощью ЦСБ70 этиопластов элонгации транскрипции в лизатах хлоропластов и этиопластов
4. Заключение.
5 Выводы:
6 Благодарности
7 Список цитированной литературы

соответствующего субстрата фосфатная группа переносится на остаток аспартата. В качестве акцептора фосфата выступают остатки аспарагиновой кислоты регулятора ответа. Все три стадии требуют ионов двухвалентных металлов. [Stock et. al. 2000]. Бактериальные гистидиновые протеинкиназы и регуляторы ответа включают набор семейств генов, имеющих высокую степень гомологии как по аминокислотной последовательности, так и по пространственной организации молекул. Похожесть этих сигнальных белков позволяет предположить наличие перекрестного узнавания между различными частями двукомпонентной системы. И хотя, с одной стороны, перекрестная сигнализация может помочь эффективнее реагировать на сигналы, во многих случаях желательна или даже необходима строго индивидуальная передача внешнего сигнала и перевод его в комплекс соответствующих биохимических реакций в клетке; при этом она должна исключать перекрестное взаимодействие. Учитывая важность для жизнедеятельности клеток правильности реализации внешних сигналов, возможность перекрестной передачи сигнала и связанные с этим процессы интенсивно исследуются [Warner et. al. 1992].
Одним из хорошо изученных явлений перекрестной сигнализации с участием гистидиновой протеинкиназной системы является ответ Е coli при анаэробном культивировании на нитрите и нитрате как акцепторе электрона. Регулирование генов, необходимых для данного процесса, контролируется рецепторными гистидиновыми протеинкиназами Nar-X и Nar-Q и регуляторами ответа Nar-L и Nar-P [Steward et. al. 2003]. Nar-X предпочтительно отвечает на нитрат и фосфорилирует Nar-L, a Nar-Q, с другой стороны, отвечает на нитрит и нитрат и форсфорилирует оба регулятора ответа Nar-L, и Nar-Q [Stewart and Bledsoe 2003]. И хотя Nar-X необходима клетке для того, чтобы различать сигналы от нитрита и нитрата, регуляторы ответа Nar-L и Nar-P имеют одинаковые участки связывания на ДНК, но имеют различную аффинность связывания с ними. Для Nar-L имеется еще один участок ДНК, с которым он взаимодействует, но с которым не взаимодействует Nar-Р [Darwin et. al. 1997]. Такой тип перекрестной передачи сигнала с участием двух