Процессивность ферментов эксцизионной репарации оснований

• Автор: Мечетин, Григорий Вениаминович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Содержание
1. Список принятых сокращений
2. ВВЕДЕНИЕ
3.1. Повреждения ДНК и их последствия
3.1.1. Апурин-апиримидиновые сайты
3.1.2. Урадил и другие продукты дезаминирования оснований ДНК
3.1.3. Продукты электрофильного присоединения
3.1.4. Фотопродукты
3.1.5. Окислительные повреждения ДНК
3.1.5.1. Окислительные повреждения пиримидиновых оснований
3.1.5.2. Окислительные повреждения пуриновых оснований
3.2. Репарация ДНК
3.2.1. Эксцизионная репарация оснований
3.2.1.1. Структура, свойства и механизм действия ДНК-У-г.тикозилаз
3.2.1.2. Структура, свойства и механизм действия АП-эндонуклеаз
3.2.1.3. Механизм дискриминации повреждений ДНК-Ы-гликозилазами и
АП-эндонуклеазами
3.3 Механизмы поиска специфических мишеней ДНК-зависимыми белками

3.3.1 Влияние дополнительных последовательностей и макромолекулярного
окружения на механизмы поиска мишеней ДНК-зависимыми белками
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1. Реактивы
4.2. Дезоксирибоолигонуклеотиды
4.3. Ферменты
4.4. Штаммы бактерий и клеточные линии
4.5. Получение экстракта клеток Е
4.6 Получение экстракта клеток Ю?М1-8226
4.7. Определение суммарной концентрации белка в экстрактах Е. соИ и клеток
линии ЯТМ1-8226
4.8. Гель-электрофорез и количественный обсчет результатов экспериментов
4.9. Введение радиоактивной метки в дезоксирибоолигонуклеотиды
4.10. Стандартные условия отжига комплементарных цепей олигонуклеотидов

4.11. Получение субстратов для изучения коррелированного расщепления
4.12. Определение кинетических параметров расщепления субстратов, содержащих единичное повреждение
4.13. Изучение коррелированного расщепления субстратов, содержащих два повреждения
4.14 Анализ зависимости величины вероятности коррелированного поиска от расстояния между сайтами расщепления
4.15 Анализ распределения поверхностного потенциала и заряда ДНК-связывающей области для урацил-ДНК-гликозилаз и АП-эндонуклеаз
5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Основы предложенного метода
5.2. Влияние условий реакции, имитирующих внутриклеточные условия, на коррелированное расщепление субстратов ферментом Ung из E. coli
5.3. Коррелированное расщепление ДНК полноразмерной урацил-ДНК-
гликозилазой человека и ее каталитическим доменом
5.4. Коррелированный поиск мишеней АП-эндонуклеазами АРЕХ1 и Nfo из человека и E
5.5. Влияние расстояния между фермент-специфическими сайтами на вероятность коррелированного расщепления Ung из E
5.5.1. Проверка теории Белоцерковского-Зарлинга
5.5.2. Определение параметров коррелированного поиска Ura ферментом Ung из E. coli при помощи теории Белоцерковского-Зарлинга
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7. ВЫВОДЫ
8. ПРИЛОЖЕНИЯ
9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Список принятых сокращений
3-met Ade 3-метиладенин
5-metCyt 5-метилцитозин
5-OH-Cyt 5-гидроксицитозин
5-OH-dCTP 5-гидроксидезоксирибоцитидинтрифосфат
5-OH-dCyd дезоксирибо-5-гидроксицитидин
5-OH-Ura 5-гидроксиурацил
5-OH-dUra дезоксирибо-5-гидроксиурацил
5-OH-dUrd дезоксирибо-5-гидроксиуридин
5-OH-dUTP 5-гидроксидезоксирибоуридинтрифосфат
7-metGua 7-метилгуанин
8-oxoAde 8-оксо-7,8-дигидроаденин
8-oxoGua 8-оксогуанин
8-oxodGua дезоксирибо-8-оксогуанозин
Ade аденозин
Gua гуанозин
Cyt цитозин
ATP аденозинтрифосфат
dAdo дезоксирибоаденозин
dAMP дезоксирибоаденозинмонофосфат
dGMP дезоксирибогуанозинмонорфосфат
dGuo дезоксирибогуанозин
dCMP дезоксирибоцитидинмонофосфат
dCyd дезоксирибоцитидин
dNMP дизоксирибонуклеотидмонофосфат
Thd дезоксириботимидин
dTMP дезоксириботимидинмонофосфат
dUMP дезоксирибоуридинмонофосфат
dUrd дезоксирибоуридин
dUTP дезоксирибоуридинтрифосфат
Fapy-Gua 2,6-диамино-4-оксо-5-формамидопиримидин
F ару-Ade 4,6-диамино-5 -формамидоаденин
НШ мотив «спираль — шпилька — спираль» (Helix — hairpin — Helix)

специфической мишенью белок расщепляет ДНК и высвобождает ее (как ДНК-гликозилазы или эндонуклеазы рестрикции) или остаётся связанным с мишенью (как LacI).
Интерсегментный перенос молекулы белка между различными удаленными участками цепи ДНК при их сближении в пространстве без высвобождения ДНК. Интерсегментный перенос возможен лишь при наличии в молекуле белка двух участков связывания ДНК [161,162].

frsTr
тХ-'

Рис. 12. Механизмы поиска специфических мишеней (X) ДНК-зависимыми ферментами. Слайдинг (А), хоппинг (Б), дистрибутивный механизм (В) и механизм интерсегментного переноса (Г).
Способы 1 и 2 объединяются под названием коррелированных механизмов поиска, так как положение белка на контуре ДНК в любой момент времени коррелирует с его положением в предыдущий момент времени. При характеризации вероятности фермента остаться связанным с ДНК после каталитического акта расщепления специфической мишени говорят о коррелированном расщеплении или процессивности фермента [161].
Ввиду того что связывание большинства белков с ДНК имеет электростатический характер, термодинамическая константа ассоциации ДНК-белкового комплекса уменьшается при увеличении ионной силы среды [160], что ведёт к увеличению вклада дистрибутивного механизма при возрастании концентрации солей вплоть до полного