Регуляция экспрессии гена D-глюкуронил C5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной и предстательной железы человека

• Автор: Мостович, Людмила Андреевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 105 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Гепаран сульфат ПРОТЕОГЛИКАНЫ
1.2 Биосинтез гепарансульфат протеогликанов
1.3 О-ГЛЮКУРОНИЛ С5-ЭПИМЕРАЗА
1.4 РОЛЬ О-ГЛЮКУРОНИЛ С 5 -ЭПИМЕРАЗЫ В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ
1.5 Механизмы регуляции экспрессии генов в канцерогенезе
1.5.1 Метилирование ДНК
Методы детекции метилирования ДНК
1.5.2 Модификация гистонов
1.5.3 микроРНК
1.6 Механизмы регуляции экспрессии Б-глюкуронил С5-ЭПИМЕРАЗЫ
1.6.1 Роль трансактивационного комплекса р-катенин/ТСГ4 в регуляции СЬСЕ
1.6.2 Роль микроРНК-218 в регуляции экспрессии СЬСЕ
1.6.3. Регуляция экспрессии других генов биосинтеза гепарансульфатов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Клеточные культуры
2.2.2 Обработка клеток дезоксиазацитином и трихостатином А
2.2.3 Выделение РНК
2.2.4 Измерение концентрации нуклеиновых кислот и белка
2.2.5 Обратная транскрипция
2.2.6 Анализ экспрессии генов методом мультиплексной ОТ-ПЦР
2.2.7 Горизонтальный электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
2.2.8 Количественная ПЦР в реальном времени
2.2.9 Вестерн-блот анализ
2.2.10 Определение возможных механизмов противоопухолевого действия гена
(ПСЕ
2.2.11. Выделение геномной ДНК
2.2.12 Бисульфитная обработка ДНК
2.2.13 Метил-специфичная ПЦР
2.2.14 Обработка ДНК СрС метилтранферазой
2.2.15 Бисульфитное секвенирование
2.2.16 ПЦР в реальном времени для микроРНК
2.2.17 Хроматиновая иммунопреципитация (СЫР)
2.2.18 Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Влияние СЬСЕ на сигнальные пути канцерогенеза
3.1.1. Карцинома молочной железы
3.1.2 Рак предстательной железы
3.1.3 Мелкоклеточный рак легкого

3.2 Молекулярные механизмы инактивации D-глюкуронил С5-эпимеразы в
ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ
3.2.1 Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых тканях молочной и предстательной железы
3.2.1.1 Молочная железа
3.2.1.2 Предстательная железа
3.2.2 Роль метилирования промоторной области в регуляции экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых тканях человека
3.2.2.1 Молочная железа
3.2.2.2 Предстательная железа
3.2.3 Изучение эпигенетической регуляции экспрессии гена D-глюкуронил С5-этшеразы in vitro
3.2.3.1 Клетки карциномы молочной железы MCF7
3.2.3.2. Клетки рака предстательной железы
3.2.4 Влияние структуры хроматина на экспрессию гена D-глюкуронил-С5-

этшеразы
3.2.5 Роль комплекса транскрипционных факторов ТСР4//3-катенин в регуляции D-глюкуронил С5-эпимеразы
3.2.6 Роль микроРНК-218 в регуляции GLCE в клетках рака молочной железы и предстательной железы
ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений
ПГ- протеогликаны
ГАГ- гликозаминогликаны
ВКМ - внеклеточный матрикс
GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа GlcN- глюкозамин GalN- галактозамин GlcUA- глюкуроновая кислота IdoUA- идуроновая кислота ГС- гепарансульфат ГСПГ- гепарансульфат протеогликан ПЦР - полимеразная цепная реакция мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота GLCE - D-глюкуронил С5-эпимераза NDST - N-деацетилаза-М-сульфотрансфераза HS2ST - гепарансульфат 2-О-сульфотрансфераза HS6ST - гепарансульфат 6-О-сульфотрансфераза 3-OST - З-О-сульфотрансферазы SULF2 - сульфатаза-2 DNMT - ДНК-метилтрансфераза HDAC - гистоновая деацигелаза CTNN1 - (3-катенин TCF4 - T-cell factor ПААГ - полиакриламидный гель ChIP -хроматиновая иммунопреципитация SE - ошибка среднего
подложку олигонуклеотидными пробами, комплементарными соответствующим микроРНК.
• Метод, основанный на применении полистиреновых шариков (например, Luminex FlexmiR™) также позволяет одновременно определять множество микроРНК (Luminex FlexmiR™ MicroRNA Human Panel instructions). Пробы, специфически связывающие микроРНК, связаны с полистиреновыми микросферами, несущими также на своей поверхности два флуоресцентных красителя. Различные комбинации красителей позволяют идентифицировать микросферы с помощью проточной цитометрии. Такой способ позволяет различить даже высоко гомологичные микроРНК одного семейства (Bartels et al, 2009).
1.6 Механизмы регуляции экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы
Несмотря на то, что гены ферментов биосинтеза широко изучаются и многие из них уже достаточно полно охарактеризованы, регуляция экспрессии D-глюкуронил С5 эпимеразы изучена мало, на данный момент существует лишь несколько работ на эту тему. Чтобы определить механизмы регуляции GLCE, в работе Ghiselli и Agward была клонирована и охарактеризована промоторная область этого гена (Ghiselli et al, 2005) (Рис. 12).