Идентификация и биохимическая характеристика геновариантов парэховирусов человека

• Автор: Зверев, Владимир Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Открытие парэховирусов человека, их таксономическое положение
1.2 Структурная и молекулярная организация парэховирусов
1.2.1 Архитектура и физические свойства вириона
1.2.2 Организация генома
1.2.3 Вирусные протеины
1.3 Генетические взаимоотношения ПЭВ
1.3.1 Генетические взаимоотношения ПЭВ с другими представителями семейства РКогпахтВае
1.3.2 Генетические взаимоотношения ПЭВ с представителями рода РагесЫтгш
1.3.3 Генетическое разнообразие и эволюция парэховирусов человека
1.4 Характеристика ПЭВ инфекции
1.4.1 Значимость ПЭВ в инфекционной патологии человека
1.4.2 Клинические проявления ПЭВ инфекции
1.5 Методы обнаружения и типирования ПЭВ
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Исследуемые объекты
2.2 Обнаружение и типирование РНК парэховирусов методом ОТ-ПЦР
2.3 Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов кДНК методом секвенирования
2.4 Объемы проведенных исследований
2.5 Статистический анализ результатов
2.6 Нормативно-методические материалы
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Оптимизация универсального метода ОТ-ПЦР для выявления РНК
парэховирусов человека и его апробация
3.1.1 Выбор праймеров
3.1.2 Оптимизация условий проведения ПЦР
3.1.3 Апробация методики для обнаружения РНК ПЭВ на клиническом материале
3.1.4 Обнаружение ПЭВ с использованием оптимизированной методики ОТ-ПЦР
3.2 Разработка и применение методики на основе ГТЦР для определения типа ПЭВ
3.2.1 Разработка «гнездового» варианта ПЦР для идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов
3.2.2 Применение ПЦР на основе типовых праймеров для идентификации ПЭВ І-го, 3-го и 6-го типов
3.3 Молекулярная характеристика ПЭВ: анализ на основе нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
3.3.1 Филогенетический анализ российских изолятов парэховирусов человека
3.3.2 Анализ аминокислотной последовательности фрагментов капсидных белков УР1 и УРЗ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. - аминокислотные остатки
дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты
кДНК - комплементарная ДНК
н.о. - нуклеотидные основания
ОГЭ - острый гастроэнтерит
ОКИ - острая кишечная инфекция
ОРС - открытая рамка считывания
ОТ-ПЦР - обратная транскрипция/полимеразная цепная реакция
п.н. - пара нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЭВ - парэховирусы человека
РИК - рибонуклеиновая кислота
ПЭВ - парэховирусы человека
ЦПД - цитопатогенное действие
ЭВ -знтеровирусві
5'НТР - 5'нетранслируемый регион

вирусологическим методом - культурой клеток, на которой плохо растут ПЭВ. С целью одновременной детекции ЭВ и ПЭВ разработаны два варианта одношаговой ПЦР в реальном времени для исследования клинических образцов, которые легла в основу создания двух коммерчески доступных комплектов реагентов. Оба метода (метод I - Платиновый комплект; метод II -Экспресс-яРСЯ-комплект) основаны на праймерах, специфичных в отношении 5'НТР генома ЭВ и ПЭВ. Праймеры охватывают весь диапазон групп ЭВ от А до Б и все известные к настоящему времени типы ПЭВ. Анализ чувствительности методов по конечной точке продемонстрировал сопоставимую чувствительность метода для ЭВ и ПЭВ (метод I -приблизительно 10 копий за реакцию для обеих целей; метод II - 20 копий за реакцию). Учитывая, что стандартный срок выполнения работы меньше чем 3 часа, мультиплексный однораундовый метод ОТ-ПЦР обеспечивает быстрое диагностическое тестирование на ЭВ и ПЭВ в случаях инфекций центральной нервной системы в клинически соответствующий период времени [10].
Последние достижения в области разработки методов на основе ПЦР -разработка мультиплексных вариантов. Разработана качественная мультиплексная ПЦР для обнаружения всех пикорнавирусов человека -энтеровирусов, риновирусов, парэховирусов, вируса АюЫ и вируса гепатита А. ПЦР базировалась на праймерах, специфичных в отношении 5'НТР генома, идентификацию проводили методом молекулярной гибридизации с родоспецифичными зондами, мечеными дигоксигенином. Чувствительность такой мультиплексной ОТ-ПЦР была равна 10-100 пикорнавирусным геномным эквивалентам. Результаты моноплексной и мультиплексной постановки ПЦР были сопоставимы при исследовании 23 клинических образцов, включающих спинномозговую жидкость, сыворотку и носоглоточные смывы. Кроме того, проведено исследование 68 проб стула на присутствие парэховирусов. ПЭВ был обнаружен в 1 случае [51]. Полученные результаты позволили авторам позитивно оценить возможности универсальной для пикорнавирусов системы детекции.