Клонирование кДНК и функциональный анализ нового белка человека СВР1, принадлежащего к классу КН-доменных белков

• Автор: Лукьянова, Татьяна Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Полифункциональные белки: связь между транскрипционными 9 и пост-транскрипционными процессами в клетке
II. Особенности структуры йнВЧР белков
1. КВО/НРМ/ШР-СБ домен
2. КСв мотив
3. K-Honlology домен
4. Дополнительные домены
III. Пост-транскрипционные и пост-трансляционные 16 модификации
IV. Свойства и функции ЬпКЧР белков
1. Специфичность связывания с нуклеиновыми кислотами
2. Роль 1т1ШР белков в упаковке мРНК
3. Спаривание цепей РНК
4. Взаимодействие с другими белками
5. Роль ЬпШЧР белков в сплайсинге
6. Роль ИпЮЧР белков в транспорте зрелой мРНК из ядра
в цитоплазму
7. Специфическая экспрессия Ьп!Р белков в различных
типах клеток и участие из в развитии заболеваний

V. Класс КН-доменных белков
1. Связывание hnRNP К с нуклеиновыми кислотами
2. КН-домен - основной структурный и функциональный
элемент класса КН-доменных белков
VI. Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Ферменты и реактивы
Выделение плазмидной ДНК
Агарозный гель-электрофорез ДНК и выделение
фрагментов ДНК из геля
Плазмиды и клонирование
Определение нуклеотидной последовательности ДНК
Культуры клеток
Штаммы бактерий
Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК
Выделение тотальной РНК и очистка поли-(А)+ РНК
Фракционирование РНК в агарозном геле,
содержащем формальдегид
Перенос РНК на нейлоновую мембрану Hybond N+
Нозерн-блот гибридизация
Радиоактивное мечение ДНК-зонда с
использованием рассеянной затравки
Выделение геномной ДНК из клеток человека и
анализ ее по Саузерну
Клонирование кДНК СВР1 с помощью стратегии
вычитания
Полимеразная цепная реакция

Обратная транскрипция
Получение делеционных конструкций с
помощью экзонуклеазы BAL31
in vitro транскрипция и трансляция
Анализ связывания белка СВР1 и его делеционных
вариантов с олиго-<1( С ) последовательностью
Компьютерная обработка результатов и
использованные базы данных
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Клонирование кДНК нового белка человека СВР1
Анализ нуклеотидной последовательности
клонированной кДНК
Экспрессия гена СВР1 в различных тканях человека
Экспрессия гена СВР1 в различных клеточных
линиях человека
Экспрессия белка СВР1 in vitro
Изучение копийности гена СВР1 в геноме человека
Функциональный анализ белка СВР1
Изучение структуры “вариабельного“ участка мРНК СВР1
Определение функциональной значимости
различных участков белка СВР1
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

HnRNP К
Кислый KHI

/ / # RGG f ь KH3
COOH

Рис. 5. Схема доменной организации hnRNP К. Домены белка соответствуют следующим аминокислотным остаткам (а.к.о) последовательности: кислый домен - 1-40 а.к.о.;
КН1 домен - 46-98 а.к.о.; КН2 домен - 149-197 а.к.о.; КНЗ домен - 391-439 а.к.о.; RGG мотив - 236-274 а.к.о.; 8гс-8НЗ-связывающий домен - 289-315 а.к.о;
домен связывания с транскрипционным репрессором Zikl - 209-337 а.к.о.; домен связывания с
К-протеинкиназой (КПК) - 337-425 а.к.о