Конструирование и применение новых кремнеземных сорбентов для хроматографии биополимеров

• Автор: Офицеров, Вячеслав Иванович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 206 с. : ил.

Оглавление
Список использованных сокращений
Введение б
Глава 1. Кремнеземные сорбенты в хроматографии биополимеров
(Обзор литературы)
1.1. Особенности хроматографии биополимеров
1.2. Методы модфикации кремнеземов, используемые для получения хроматографических сорбентов
1.3. Ионообменная хроматография
1.3.1. Анионообменная хроматография
1.3.2. Катионообменная хроматография
1.4. Гель-проникаюгцая хроматография
1.5. Аффинная хроматография
1.6. Обращенно-фазовая хроматография
1.7. Гидрофобная хроматография
1.8. Заключение 48 Глава 2. Получение и исследование свойств новых кремнеземных сорбентов для ионообменной и аффинной хроматографии биополимеров
2.1. Анионообменные сорбенты
2.2. Катионообменные сорбенты
2.3. Сорбенты для аффинной хроматографии 78 Глава 3. Получение высокоочищенных гидрофобных белков
с помощью обращенно-фазовой хроматографии
Глава 4. Примеры использования разработанных сорбентов для решения исследовательских и практических задач
4.1. Выделение гидрофобных белков с помощью ОФХ,
изучение их строения и свойств
4.2. Применение композиционных анионитов для
хроматографии протяженных олигодезоксирибонуклеотидов

4.3. Использование новых анионитов для очистки
иммуноглобулинов класса О
4.4. Анализ подклассов 1§С с помощью ИОХ на новых анионитах.
Состав и свойства подклассов 1§в в сыворотках крови животных
4.5. Получение высокоочищенных препаратов лошадиных
иммуноглобулинов против вируса клещевого энцефалита
4.6. Применение композиционных аффинных сорбентов
для получения высокоочищенных антигенов и антител
Глава 5. Экспериментальная часть
5.1. Реактивы и материалы
5.2. Оборудование
5.3. Синтез и изучение свойств сорбентов
5.3.1 Анионо- и катионообменные сорбенты
5.3.2 Сорбенты для аффинной хроматографии
5.3.3 Сорбенты для обращенно-фазовой хроматографии гидрофобных белков и полипептидов
5.4. Выделение, структурная характеризация и изучение свойств белков
5.4.1. Общие методы анализа белков
5.4.2.Исследование структуры и свойств вирусных и рекомбинантных белков
5.4.3. Выделение фракции иммуноглобулина О, анализ и изучение свойств подклассов 1§0 животных
Заключение
Выводы
Документы по внедрению результатов диссертационной работы
Литература
От автора

Список использованных сокращений:
АФХ - аффинная хроматография;
БАВ - биологически активные вещества;
ВВЭЛ- вирус венесульского энцефаломиелита лошадей;
ВВсЭЛ- вирус восточного энцефаломиелита лошадей ВКЭ - вирус клещевого энцефалита;
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;
ГПХ - гель-проникающая хроматография;
ГФХ - гидрофобная хроматография;
ДЭГ - диэтиленгликоль;
ИОХ - ионообменная хроматография;
ИФА - иммуноферментный анализ;
кДа - килодальтон
МПС - макропористое стекло;
ОФХ - обращенно-фазовая хроматография;
ОЕ260 - количество вещества с оптической плотностью при 260 нм, равной единице.
ПААТ - полиакриламидный гель;
ПВП - поливинилпирролидон;
ПВС - поливиниловый спирт;
ПЭИ- полиэтиленимин;
РИА - радиоиммуный анализ;
PH - реакция нейтрализации;
РТГА - реакция торможения гемагглютинации;
ТФУ - трифторуксусная кислота;
BSA - бычий сыворотояный альбумин;
CPG - стекло с контролируемым размером пор;
DEAE - диэтиламиноэтил;
НА - гемагглютинин;
НЬ - гемоглобин;

ксипропил)триметоксисиланом [103]. Такие матрицы с привитыми на поверхность эпоксигруппами были использованы для иммобилизации лигандов, содержащих аминогруппы. Однако выяснилось, что скорость данной реакции весьма невысока (время полупревращения 9,5 часов), а ёмкость полученного сорбента в 10-30 раз ниже, чем носителей с аналогичными лигандами, полученными на основе BrCN-сефарозы [104].
Синтезированные из 2,3-эпоксипропилкремнеземов носители с ди-ольным или полиольным покрытием, помимо использования для ГПХ (см. раздел 1.4), были применены для иммобилизации различных лигандов с аминогруппами, либо через аминосодержащий спейсер. Для этого их активировали 1,Г-кабонилдиимидазолом, 4-нитрофенил- или N-гидрокси-сунцинимидилхлорформиатами, а также окисляли в альдегиды [105]. Полученные при иммобилизации различных лигандов сорбенты обладали достаточно высокой емкостью и были успешно использованы для аффинной очистки веществ в режиме ВЭЖХ.
Ряд аффинных носителей был получен на основе кремнеземом с привитыми и 3-аминопропильными группами с помощью различных методов иммобилизации лигандов [106,107]. Воспроизводимый и эффективный метод синтеза, включающий использование N-гидроксисукцинимидного эфира сукцинил-3-амидопропил-силикагеля предложил Яретт [108]. В отличие от эпоксизамещенных кремнеземов реакция такого активированного эфира с аминогруппами лигандов полностью завершается за несколько минут. Показано, что синтез аффинного сорбента может быть проведен in situ в колонке, заполненной сукцинил-3-амидопропилсиликагелем, при последовательном прокачивании растворов реагентов.
Следует отметить, что некоторые аффинные сорбенты, полученные на основе кремнеземов с привитыми «щеточными» группами, способны к неспецифическому связыванию веществ, происходящему за счет недостаточной экранированности силанольных групп на поверхности матрицы. Кроме того, их стабильность при хроматографии и регенерации колонок не всегда удовлетворительна.