Функциональные и структурные свойства лактатдегидрогеназы при температурной адаптации рыб

• Автор: Персиков, Антон Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.13
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Температурные адаптации белков
2.1.1. Физиологический уровень адаптаций: как перестраивается метаболизм в ответ на изменение температуры
2.1.2. Воздействие температуры на функциональные и структурные свойства ферментов
2.2. Строение лактатдегидрогеназы
2.2.1. Структура и свойства лактатдегидрогеназы
2.2.2. Строение активного центра ЛДГ
2.2.3. Воздействие температуры на функциональные и структурные свойства ЛДГ
2.3. Термодинамические свойства белков при температурной денатурации и механизмы их термостабильности
2.3.1. Денатурация небольших глобулярных белков
2.3.2. Денатурация сложных белков
2.3.3. Взаимодействие белков с лигандами
2.3.4. Анализ необратимых переходов в белках
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Краткая характеристика объектов
3.2. Выделение лактатдегидрогеназы из мышц рыб
3.3. Определение активности ЛДГ
3.4. Определение максимальной скорости реакции
3.5. Термоинактивация ЛДГ
3.6.Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия
3.9. Деконволюция кривых ДСК
3.8. Измерение абсолютной величины теплоемкости нативной и денатурированной формы ЛДГ
3.9. Кинетическое исследование температурной денатурации

3.10. Определение содержания ионов цинка в ЛДГ методом рентгеноспектрального флуоресцентного анализа
3.11. Компьютерный анализ трехмерной структуры молекулы М4-ЛДГ
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Влияние температуры на активность ЛДГ ,
4.1.1. Температурный оптимум ферментативной реакции
4.1.2. Кинетика температурной инактивации ЛДГ
4.1.3. Определение термодинамических параметров ферментативной реакции для «холодной» и «теплой» ЛДГ
4.2. Микрокалориметрическое исследование температурной денатурации ЛДГ
4.2.1. Температурная зависимость избыточной теплоемкости ЛДГ
4.2.2. Изменение термодинамических параметров денатурации ЛДГ при разных pH раствора
4.2.3. Анализ деконволюции калориметрических кривых
4.2.4. Вычисление температурной зависимости изменения свободной энергии Гиббса при денатурации
4.3. Определение теплоемкости «холодной» и «теплой» ЛДГ в нативной и денатурированной форме
4.3.1. Измерение теплоемкости ЛДГ в нативной форме при 25°С
4.3.2. Измерение теплоемкости денатурированной формы ЛДГ при 25°С
4.3.3. Вычисление теплоемкости денатурированной формы ЛДГ по аминокислотному составу
4.4. Кинетические особенности температурной денатурации ЛДГ
4.5. Исследование возможности связывания ионов цинка молекулой ЛДГ
4.6. Измерение содержания цинка в молекуле «холодной» и «теплой» форм ЛДГ
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1. Функциональные свойства ЛДГ из мышц вьюна при адаптации к разным температурам

5.1.1. Температурный оптимум ферментативной реакции ЛДГ
5.1.2. Кинетика термоинактивации фермента
5.1.3. Термодинамические параметры ферментативной реакции для «холодной» и «теплой» ЛДГ
5.2. Микрокалориметрическое исследование температурной денатурации ЛДГ
5.2.1. Анализ температурной зависимости избыточной теплоемкости ЛДГ. Калориметрическая энтальпия денатурации ЛДГ
5.2.2. Влияние pH на термодинамические параметры тепловой денатурации ЛДГ
5.2.3. Анализ деконволюции кривых плавления «холодной» и «теплой» ЛДГ
5.2.4. Температурная зависимость изменения свободной энергии Гиббса при денатурации «холодной» и «теплой» ЛДГ
5.3. Определение теплоемкости «холодной» и «теплой» ЛДГ в нативной и денатурированной форме
5.4. Особенности необратимого характера температурной денатурации «холодной» и «теплой» ЛДГ
5.4.1. Доказательство применимости термодинамики обратимых процессов к анализу денатурации ЛДГ
5.4.2. Кинетический анализ температурной денатурации ЛДГ
5.5. Изучение возможности связывания ионов цинка молекулой ЛДГ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

тонкие изменения в структуре и функции белков (Vallee et al., 1991). Результат влияния ионов металлов на каталитические свойства ферментов может быть и негативным. Например, активность фосфатазы из Escherichia coli повышалось при присоединении ионов Mg2+ и Са2+, однако, при связывании этого фермента с ионом Zn2+, наблюдали существенный спад его активности (Tsuruta et al., 1998). Аналогично, при непрямом лигандировании цинком карбоангидразы II, чрезвычайно сильно понижается каталитическая активность этого фермента и его сродство к сульфонамиду (Huang et al, 1996).
Наличие цинк-пальцевых последовательностей обнаружено во многих белках: карбоангидразе I и II, щелочной фосфотазе, фосфолипазе С, термолизине, алкогольдегидрогеназе и др. (Vallee, Auld, 1990; Mely et al., 1996; Huang et al, 1996). Существование таких цистеин-гистидиновых пар в мономере лактатдегидрогеназы также, как и возможность координирования отдельных цистеинов и гистидинов в тетрамере фермента, дает возможность предположить, что ионы цинка связываются с молекулой ЛДГ (Биркая и др., 1990; Киладзе и др., 1996).
2.3.4, Анализ необратимых переходов в белках.
В большинстве работ по анализу термограмм ДСК белков полагают, что параметры денатурации не зависят от скорости нагревания, т.е. являются равновесными (Кубе и др., 1987; Sasso et al., 1995; Welfle et al., 1996 и др.). Соблюдение этого условия установлено экспериментально лишь в отдельных случаях (Privalov, Khechinashvili, 1974; Moses, Hinz, 1983; Schöppe et al., 1997). Многие сложные белки при повышении температуры денатурируют необратимо, что регистрируется строгой зависимостью термодинамических параметров денатурации белка и отсутствием конформационных переходов при повторном сканировании на дифференциальном сканирующем калориметре (Sanchez-Ruiz et al