Характеристика систем рестрикции-модификации II типа в коллекции природных штаммов семейства Enterobacteria-ceae и рода Pseudomonas

• Автор: Перцев, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 179 с.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Системы рестрикции-модификации прокариот
1.1.1. Явление рестрикции-модификации
1.1.2. Номенклатура сайт-специфических эндонуклеаз и ДНК-метилтрансфераз
1.1.3. Классификация ферментов системы рестрикции-модификации
1.1.4. Изомеры
1.1.5. Ферменты системы рестрикции-модификации I типа
1.1.6. Ферменты системы рестрикции-модификации II типа
1.1.6.1. Системы рестрикции-модификации П-Б субкласса
1.1.6.2. Системы рестрикции-модификации П-Е субкласса
1.1.7. Системы рестрикции-модификации Ш-го типа
1.1.7. Системы рестрикции-модификации ГУ-го типа
1.1.8. Молекулярная организация систем рестрикции-модификации
1.1.9. Распространение систем рестрикции-модификации
1.1.10. Выделение и очистка ферментов рестрикции-модификации
1.1.10.1. Разделение нуклеиновых кислот и сайт-специфических эндонуклеаз
1.1.10.2. Очистка ферментов рестрикции-модификации
1.1.11. Некоторые физико-химические и энзиматические свойства сайт-специфических эндонуклеаз и ДНК-метилтрансфераз
1.1.11.1. Физико-химические свойства
1.1.11.2. Влияние различных факторов на активность эндонуклеаз рестрикции
1.2. Непарные ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции
1.3. Метилирование ДНК эукариот
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
II. 1. Материалы
И. 1.1. Штаммы бактерий, бактериофаги, фаговые и пдазмидные вектора
II. 1.2. Среды и основные буферы
II. 1.3. Материалы и реактивы
11.2. Методы исследования

П.2.1. Поиск штаммов-продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз
11.2.2. Получение бактериальной биомассы
11.2.3. Выделение плазмидной ДНК
И.2.3.1. Лизис кипячением
11.2.3.2. Выделение плазмид по методу Кадо и Лю
11.2.3.3. Лизис щелочью
11.2.3.4. Очистка ДНК в градиенте хлористого цезия
11.2.3.5. Удаление примесей РНК из препарата ДНК
И.2.4. Получение препаратов фагов Г vir, Л.СІ857 и cpSOvir в высоком титре
11.2.5. Выделение ДНК фагов Хс1857 и 11.2.6. Периодическое культивирование штаммов
11.2.7. Очистка обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз
11.2.8. Определение ферментативной активности
сайт-специфических эндонуклеаз
11.2.9. Определение сайта узнавания и места расщепления фосфодиэфирной связи на субстратной ДНК, обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз
11.2.10. Определение оптимальных условий реакции для обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз
11.2.11. Получение компетентных клеток E. coli и их трансформация
11.2.12. Перенос плазмидной ДНК при помощи конъюгации
11.2.13. Определение локализации генов, обнаруженных систем рестрикции-модификации
11.2.14. Гибридизация плазмидных ДНК
11.2.15. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
11.2.16. Скрининг рекомбинантных клонов
11.2.17. Препаративное выделение фрагментов ДНК
11.2.18. Лигирование фрагментов ДНК
11.2.19. Фосфорилирование олигонуклеотидных праймеров полинуклеотид-киназой фага Т4
11.2.20. Клонирование гена эндонуклеазы R'üco29kI
11.2.21. Клонирование гена эндонуклеазы R'£co29kI-N6His

11.2.22. Клонирование гена ДНК-метилтрансферазы M'£eo29kI
11.2.23. Экспрессия гена эндонуклеазы R’£co29kl
И.2.24. Экспрессия гена эндонуклеазы R'i?co29kI-N6His
И.2.25. Экспрессия гена ДНК-метилтрансферазы M'£co29kI
11.2.26. Очистка эндонуклеазы рестрикции £со29к! до гомогенного состояния
11.2.27. Очистка эндонуклеазы рестрикции КЕсо29kI-NT6IIis до гомогенного состояния
11.2.28. Электрофорез ДНК и белков
11.2.29. Определение молекулярного веса R'£co29kI
11.2.30. Определение молекулярного веса M'£co29kI
11.2.31. Определение концентрации белка
11.2.32. Определение активности ДНК-метилтрансферазы M'£'co29kI
11.2.33. Статистическая обработка полученных данных
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III. 1. Поиск, очистка, идентификация и локализация генов систем
рестрикция-модификация в штаммах семейства Enterobacteriaceae
и рода Pseudomonas
III. 1.1. Поиск сайт-специфических эндонуклеаз
III. 1.2. Очистка и идентификация эндонуклеаз рестрикции, обнаруженных в штаммах P. aeruginosa: новый подход к выделению и очистке
эндонуклеаз рестрикции
III. 1.3. Очистка и идентификация эндонуклеаз рестрикции, обнаруженных
в штаммах семейства Enterobacteriaceae
III. 1.4. Локализация генов систем рестрикции-модификации II типа
в обнаруженных штаммах-нродуцентах
III.2. Рестрикционное картирование природной плазмиды рЕС029
и клонирование генов системы рестрикции-модификации Есо29к1
111.2.1. Рестрикционное картирование плазмиды рЕС029
111.2.2. Получение штамма-продуцента с увеличенным биосинтезом сайт-специфической эндонуклеазы R £co29kI
111.2.3. Создание штаммов-продуцентов с регулируемым уровнем экспрессии ферментов системы рестрикции-модификации Есо29к
111.3. Синтез эндонуклеазы рестрикции Есо29к1 клетками штамма

Гены, входящие в СРМ, обычно изучаются после их переноса и/или клонирования в лабораторные штаммы Е. coli, а не в природных штаммах-продуцентах. В связи с этим напрашивается заслуживающий внимания подход, связанный с изучением этих генов в их естественном месторасположении в природных штаммах, который поможет определить, организованы ли гены СРМ как один оперон или они как-то по другому скоординированы. Другое объяснение их близкого расположения состоит в том, что данные гены СРМ являются подвижными элементами и могут перемещаться из одного организма в другой. Близкое расположение генов СРМ возможно связано с их эволюцией, за счет того, что они выполняют функцию защиты бактериальной клетки от проникновения чужеродной ДНК и регуляция их генов должна быть сильно скоординирована.
В литературе описаны данные, по крайней мере, для нескольких СРМ, позволяющие предположить о горизонтальном и вертикальном переносе генов среди микроорганизмов. Например, для iVgoPII, выделенной из штамма Neisseria gonorrhoeae (Sullivan et al., 1987) и MthTl из Methanobacterium thermoformicicum (Nolling and De Vos, 1992), узнающих нуклеотидную последовательность 5’-GGCC-3’ и расщепляющих фосфодиэфирную связь между вторым и третьим нуклеотидом данной последовательности. После определения первичной нуклеотидной последовательности ДНК генов, кодирующих эндонуклеазы и метилазы обеих СРМ, была показана высокая гомология между ними, что предполагает общее эволюционное происхождение (Sullivan and Saunders, 1987; Nolling and De Vos, 1992). При исследовании нескольких штаммов рода Haemophilus было показано, что гены, кодирующие Valyl-tRNA-synthetase являются смежными с генами для различных СРМ (Roberts and Halford, 1993). Возможно, это общее местоположение на хромосоме служит так же для переноса генов различных СРМ в гомологичные участки на хромосоме.
Вертикальный перенос генов СРМ описан для штаммов Diplococcus pneumoniae. В одном штамме как одна кассета расположены эндонуклеаза рестрикции Dpnll и две МТ (de la Campa et al., 1987). Во втором штамме, ту же самую хромосомальную локализацию имеет другая эндонуклеаза рестрикции, Dpnl, которая узнает комплементарную последовательность эндонуклеазы Dpnll (Geier and Modrich, 1979; Ueno et al., 1993). R'DpMI является изошизомером эндонуклеазы Mbol и узнает нуклеотидную последовательность 5’-GATC-3’. Разрезание нуклеотидной последовательности на молекуле ДНК не происходит, если аденин метилирован. R'Dpnl, с другой стороны, также узнает последовательность 5’-GATC-3’, но разрезание ДНК будет только в том случае, когда аденин в последовательности узнавания будет прометилирован. Перенос генов этих СРМ может