Сиквенс-специфическая химическая модификация двуцепочечной ДНК алкалирующими производными олигонуклеотидов

• Автор: Демченко, Елена Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 128 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
ТРЕХЦЕПОЧЕЧНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
1.1. Открытие тройных комплексов
1.2. Структура триплексов
1.2.1. Нуклеотидные последовательности, способные образовывать триплексы
1.2.2. Ориентация третьей цепи
1.2.3. Конформация триплексов
1.3. Межмолекулярные и внутримолекулярные триплексы
1.4. Геометрия триплексов
1.5. Специфичность образования триплексов
1.6. Стабилизация триплексов
1.6.1. Стабилизация триплексов с помощью уменьшения отталкивания
полинуклеогидных цепей
1.6.2. Влияние pH на сстабильность триплексов
1.6.3. Зависимость стабильности триплексов от длины РиРу тракта и третьей цепи
1.6.4. Влияние гидрофобных заместителей в основаниях третьей цепи на
стабильность триплексов
1.6.5. Стабилизация тройных комплексов триплекс-специфичными лигандами
1.6.6. Некоторые особенности стабилизации межмолекулярных и внутримолекулярных триплексов
1.7 Воздействие на основные генетические процессы с помощью триплекс образующих олигонуклеотидов
ГЛАВА
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Описание выбранной модельной системы и сс характеризация.
2.2. Модификация мишени I алкилирующими производными пиримидиновых олигонуклеотидов 1 и 2.
2.3. Модификация мишеней П и III алкилирующими производными пиримидиновых олигонуклеотидов 3, 4
2.4. Модификация дцДНК производными пуриновых олигонуклеотидов
2.5. Разработка метода количественной модификации дцДНК алкилирующим производным пиримидинового олигонуклеотида
2.6. Модификация дцДНК в составе несовершенных тройных комплексов
2.7. Модификация дцДНК [32Р]-меченым алкилирующим производным олигонуклеотида
2.8. Модификация дцДНК алкилирующими производными олигонуклеотидов, несущими реакционноспособные группы на З'-концевом фосфате, либо на 5'- и У-концевых фосфатах одновременно
2.9. Определение структуры несовершенных комплексов
2.10. Модификация дцДНК в составе тройного комплекса алкилирующими производными длинного (15-мера) и короткого (6-мера) пирмидиновых олигонуклеотидов
2.11. Оценка скорости образования комплекса 15-мера с ДНК-мишенью в различных условиях с помощью гель-электрофореза в неденатурирующих условиях
2.12. Изучение эффективности модификации ДНК-мишени алкилирующим производным 15-мера в составе двух типов комплексов

2.13. Изучение зависимости степени модификации ДНК-мишени производными 6-мера и 15-мера от pH в различных солевых условиях
ГЛАВА
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.2,Методы
3.2.1. Буферные системы
3.2.2. Трансформация клеток E. coli
3.2.3. Выделение дцДНК
3.2.4. Введение 5'-конецевой 32Р метки в олигонуклеотиды
3.2.5. Синтез производных олигонуклеотидов, несущих остатки
4-(Н-2-хлорэтил-1Ч-метиламино) бензиламина на 5'-концевых фосфатах
3.2.6. Синтез феназиниевого производного олигонуклеотида - эффектора
3.2.7 Секвенирование фрагментов ДНК
3.2.8 Дот-гибридиизация ,2Р-меченных пиримидиновых олигонуклеотидов с дцДНК
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

которых два положительных заряда пространственно разнесены, более эффективны для стабилизации триплексов, чем ионы Mg2+ (Thomas & Thomas ,1993).
1.6.2. Влияние pH на стабильность триплексов
Как уже упоминалось ранее, РуРиРу триплексы, содержащие CGC+ триады, образуются при кислых pH, так как требуют протонирования N3 цитозинов третьей цепи. Этот процесс необходим, как для межмолекулярных триплексов (Lipsett, 1964; Morgan &Wells, 1968; Lee et al., 1979; Lyamichev et al., 1988), так и для Н-формы ДНК (Htun & .Dahlberg, 1988; Kohwi & Kohwi-Shigematsu, 1988). Показано также, что и некоторые PyPuPu триплексы образуются только при кислых pH; в этом случае последовательность третьей цепи такова, что возможно образование CG*A+ триад (рис. 2). Протонирование цитозинов и аденинов третьей цепи делает возможным образование двух Хугстеновеких водородных связей с основаниями пуриновой цепи дуплекса-мишени (Malkov et al., 1993а).
Теоретическая модель pH зависимых структурных переходов предполагает, что время жизни протонированвого триплекса (р) является очень существенной функцией pH (Frank-Kamenetskii, 1992): tt=To 10'NpH/r, где г - число пар оснований на один протонированный сайт, N - длина тракта в парах оснований, и То является среднегеометрической величиной времени жизни непротонированной триады. Это выражение верно в интервале pH между рКа протонированного сайта в составе одноцепочечной и рКа протонированного сайта в составе трехцепочечной структур. Такая pH зависимость очень сильна: если третья цепь содержит 10 цитозинов, время жизни изменяется в 10 раз при изменении pH на 0,1 единицы.
рКа для цитидина (рКа=4.3) и для аденозина (рКа=3.8) относительно низки. Однако в строго организованных полинуклеотидных структурах эти величины значительно выше. Например, две индивидуальные poly(dC) цепи образуют дуплекс poly(dC)poly(dC) и рКа