Экспрессия, локализация и фосфорилирование изоформ киназы легких цепей миозина в клетках животных и человека

• Автор: Чибалина, Маргарита Валериевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений, встречающихся в тексте диссертации
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Роль КЛЦМ в клеточной подвижности, опосредованной
миозином Н-го типа
1.1. Общая схема регуляции миозина II фосфорилированием
1.2. Фосфор илирование регуляторных легких цепей
гладкомышечного и немышечного миозинов КЛЦМ
1.3. Фосфорилирование РЛЦ миозина другими протеинкиназами
1.4. Роль КЛЦМ в регуляции различных форм подвижности
эукариотических клеток
2. Молекулярная организация и функциональные свойства
классической КЛЦМ
2.1. Доменная организация КЛЦМ
2.2. Активация КЛЦМ Са2+/кальмодулином
2.3. Связывание КЛЦМ с актином и миозином
2.4. Фосфорилирование КЛЦМ различными протеинкиназами и
модуляция активности КЛЦМ
3. Генетический локус КЛЦМ как пример комплексной
транскрипционной единицы у эукариот
4. Функциональные свойства продуктов генетического локуса
КЛЦМ
4.1. Функциональные свойства КЛР
4.2. Функциональные свойства высокомолекулярной изоформы
КЛЦМ
5. Экспрессия продуктов генетического локуса КЛЦМ в тканях и
клетках
5.1. Экспрессия КНР
5.2. Экспрессия изоформ КЛЦМ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы
Реактивы и материалы для биохимических и молекулярнобиологических исследований
Реактивы и материалы для клеточно-биологических
исследований
2. Методы
1. Биохимические и физико-химические методы
1.1. Определение концентрации белков
1.2. Электрофорез и денситометрия
1.3. Приготовление образцов клеток и тканей для электрофореза
2. Молекулярно-биологические методы
Создание и характеристика молекулярно-генетических
конструкций
3. Иммунологические и иммунохимические методы
3.1. Получение антител N875
3.2. Получение и характеристика моноклональных антител 2Р4
3.3. Аффинная очистка антител к КНР, КЛЦМ-108 и уникальному
фрагменту КЛЦМ
3.4. И м муно б лоттинг
3.5. Иммунофлуоресценция
3.6. Иммунопреципитация
4. Клеточно-биологические методы
4.1. Выделение и культивирование клеток
4.1.1. Выделение и культивирование гладкомьппечных клеток
4.1.2. Выделение и культивирование мезотелия
4.1.3. Культивирование линейных клеток
4.2. Экстракция КЛЦМ из культивируемых клеток

4.3. Ингибирование КЛЦМ в культивируемых клетках
4.4. Определение активации МАР-киназ
4.4.1. Определение активации р42/р44 и р38 МАРК
4.4.2. Определение активности JNK
4.5. Метаболическое мечение клеток 32Р и in vivo фосфорилирование
КЛЦМ
4.6. Окрашивание клеток Cy3-N875
4.7. Транзиторная трансфекция культивируемых клеток 55 молекулярно-генетическими конструкциями
4.8. Органная культура аорты в режиме механической стимуляции
5. Статистический анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Антитела, использованные для анализа экспрессии продуктов
генетического локуса КЛЦМ
2. Экспрессия продуктов генетического локуса КЛЦМ в органах
и тканях курицы
3. Внутриклеточная локализация КЛЦМ
3.1. Локализация КЛЦМ-210 в гладкомышечных клетках
3.2. Локализация КЛЦМ-210 в немышечных клетках,
трансфицированных плазмидой, кодирующей КЛЦМ-210-GFP
4. Некоторые функциональные свойства высокомолекулярной
изоформы КЛЦМ
4.1. Анализ взаимодействия уникального фрагмента КЛЦМ-210 с
элементами цитоскелета in vivo
4.2. Экстракция изоформ КЛЦМ из клеток
4.3. Влияние ингибиторов активности КЛЦМ на морфологию и
состояние актинового цитоскелета клеток, экспрессирующих
преимущественно одну изоформу КЛЦМ
5. Изучение экспрессии продуктов генетического локуса КЛЦМ в
культивируемых сегментах аорты и гладкомышечных
клетках аорты курицы
5.1. Экспрессия изоформ КЛЦМ в органной культуре
гладкомышечной ткани аорты при механической стимуляции

>КЛЦМ
НСОУКІ.УТ8ТЯУЗКТЗІ-ТІ.ЗРЗУРАЕАРАРП.РРІШКУ01_ЄАТАЯРЕВКУЯвУРЕРСітУУЯНВНР1-РЕаОН¥УУОН51
ЯВІРЗІ-УІКВУОЕВОЗВКУТСЕААЯ08ВУЯОУТУЕІ-ТУЕВЯЗІ.ККУЗІРЗЗАіаРВаЯ1_ЗУРРУЕНКРЗІИВЕЗРРКРАТ
КРНЯУтЕ6ОТВЯГЗСК1ТВЯРОРОУТИТКвО1Н1_аСШЕЯРММРЕКТВ10У1.Е10МУа1.АОАВ1УТСТУУНЗАСКАЗУЗ
АЕІ_ТУОВРОКТОТНАОР[.СМРРКРТТІ-АТКЛ ІЕЯЗОРКОАТБЯВ ІАКЕІ-КЗТЗТЕІ_МУЕТК0ЯІ-ЗАІСКЕТРУ ТЗЯЕАКЛВ
КОВамаЕАЯАУРІОЕЗЯВТКВРаУІ.ОКТЗЗТт-ОАУКАаРЕРІСАЕРОТТРІЯОАЕОЯі<ЯТУОРиіТТТТаЕЯР51.ТВПУ
ЗРЯЗЯЕТЕЯЯАВУЯКЗУКЕЕКЯЕРЕВІРРОРЕЗЯРОЗІ.ЕАЗЕВОЕІКПСЗКУЗВКРКРОУЕиРКЕВУРІКТВЕЄІВ1УЕЕ
СЕТНСІ-«І-ККАСІ.вОЗаЗУЗСАЛРКРЯвОТЗТЗ¥и.ТУКЯРКУЕЕУАРСРЗЗУІ.КВСТ¥ЗЕВаОРУІ-аСУУаВУРУРЕІТ
М.ІЛІЕОРІОУАНЗТРЕАВУАКЕТУООЛІ-РЕВВВІ УТСІ_А£НЯАВЯАЗС8А0УТУКЕККЗЗККАЕВТ0ААКІ.НКТГЛР ІРЕ
КВІ_Т01_КУМОВваУІНТУЕУвАЯРСРЕі іИОЖСКЕіаЕТЕ0РНРЕККСЯЕУ31.У іОЕУРРЕОТаКУТСЕАкМЕЕвЕТОТ
ОАТЕТУОЕРООВІОРІУРІЗКРЯЗУТАААаоНУЕІЗСАІАвОРРРТУНКРКОВОЕ1ТР6ТВСЕП.ОЯЕОІРТІ.{ЫЗДУОЗЯ
НАВаУЕІОІ-ЯМОУВЕСЗСОУЗІ.т.ЯЕЗЗАЗЯАЕт.ЯОВЯ£ЗАЗЗВЕЯЯОВВЯГВАІ.ТРЕЯТЗВРККЗЗЗЕТЯААЕЕЕаЕВ
>КЛЦМ-108 “
УНВКЯНУЕТЯЕНТЕЕбЕЯОВЕАЕОЕРРЯРП-СККУЗТКЗРЗЕЕОЕКЕІРАЕОНОРРАЖОНОУКРКТЕЗЕЕЕИКУНАР
ВВУ£РЯЗУиАІСКБТРКТР[-РЕКУРРРКРЛУТОРЯЗУЕВАККІСРРАЕМВЗАЗТРАРМАЯА63ЕАОНЛТРЯЗЕАРАРКРУУК 1040
КЕЕКЯОЯКСЕНВСАУУОЄВІІВККАЕЯКРААЗКРТРРРЗКВТАРЗРТЕКІ.00АКУАВВЕКІ.У1.0СЯІ БЗОРРАЗУЗИТІ-В 1120
ЗКАІКЗЗКЗІV ІЗОЕВП.СЗІЛІЕКУНРЕОСЄЕУКСІАЕМААВКАЕСАСКУІ.УЕОТЗЗТКААКРАЕККТККРКТ'П-РРУІ. 1200
ЗТЕЭЗЕАТУКККРАРКТРРКААТРРОІТОРРЕОЯКУЯАВЕЗУЕІ-ГАКУУВТАРІТСТиМКРЯКОІОЕЯЕУІКІЕМАЕЯвЗ 1280
КІЛІЗЗТКОЕНСВСУТІ-УУЕНіаВЗНаАО¥НІЛУУОКРОРРАЄТРСАЗОІЯЗЗЗІ.ТІ.З«¥вЗЗУОВВЗАУОЗУТУЕІ«МЗ 1380
УОЯКУТВЕТТСЙЗТЗЕМУВОЕОАОЯЕУКГЯУРААПУУВІЗЕРЗОЕЗЕУУКУВЕКОЕЕЕЕКЕЕЕАЕЕЗООЕаіСЕТЕУНУЯТ 1440
УТІЯТЕОКУЗОУУМІЕЕЯІ_88ВКРВВУРЯІ_УЕІСКТВКУУАВКРРКАУЗАКЕКЕНІЯОЕІЗІІ1>ІСІ.ННРКІ-УИСУОАРЕЕК 1520
АЯІУИУЕЕИУЗВВЕЕРЕНПОЕОРЕЕТЕЯЕСІКУИЯОІЗЕВУЕУІНКОВІУНЕОЕКРЕКІИСУККТСТЗІКЕІОРСЕАЯК 1800
ІЕЗАВЗИС УІ-РВТРЕРУАРЕУІЯУЕРІВУЕТОНКЭІВVІСУІІУЗВЕЗРРНВОМОЯЕТІ-АЯУТЗАТИОРООЕАРОЕ1ЭОО 1680
>КЯР
АКОРІЗЯ1.1.1СІСОІ1КЗЯІ-КСТасиаНРИІ.аіСВТКМНЕАІСіаЗКОЯИКІСУМАЯЯК«ОКТЄНАУЯАІВЯІ_ЗЗМАИІЗВМЗВЯІС 1780
АЗВвБРІЗР !ЫАОКУЕЯЕОАР1.ЕЕУАЕЕ1СРНУКРУРТКТ11-ОМЕУУЕВЗААЯРОСК ІЕВУРОРЕУНУУКОООРУКЕвЯНР 1840
ОЮУОЕЕЄЯСЗІТіЗЕУСВОВВАКУТСІСАУЯЗІ-вЕАТСТАЕІ-ІУЕТПвКЕвЕ6ЕВЕВ£ЕОЕЕЕ£ЕЕ 1906
Рис. 5. Первичная структура продуктов генетического локуса КЛЦМ.
Представлена открытая рамка считывания кДНК из базы данных ЕМВЬ (Х52876). Нумерация аминокислотных остатков показана справа. Начало кодирующей последовательности КЛЦМ-210, КЛЦМ-108 И КНР обозначено над первичной структурой. Красным подчеркнуты участки, вовлеченные в связывание КЛЦМ-108 с актином, зеленым подчеркнуты предполагаемые участки, вовлеченные в связывание с актином уникального фрагмента КЛЦМ-210.