Особенности структурно-функциональной организации и физико-химические свойства нелизосомальных пептидгидролаз мозга животных

• Автор: Генгин, Михаил Трофимович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пенза
• Количество страниц: 330 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава I. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ НЕРВНОЙ ТКАНИ
НЕЛИЗОСОМАЛЬНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ
1.1. Краткая историческая справка изучения протеолитических ферментов нервной ткани
1.2. Общая характеристика пептидгидролаз нервной ткани не-лизосомальной локализации и особенности их функций
1.3. Характеристика протеолитических ферментов нервной ткани нелизосомальной локализации и их биологическая

1.3.1. Эндопептидазы
1.3.1.1. Сигнальные пептидазы
1.3.1.2. Прогормон-конвертазы
1.3.1.3. Са~+ -зависимая нейтральная протеиназа
1.3.1.4. Нейтральная эндопептидаза 24.
1.3.1.5. Эндопептидаза 24.
1.3.1.6. Эндопептидаза 24.
1.3.1.7.Пролилэндопептидаз а
1.3.1.8. Динорфин-превращающий фермент
1.3.1.9. Тиоловая прогормон-конвертаза
1.3.1.10. АТФ, убиквитин-зависимая мультикаталити-ческая протеиназа
1.3.2. Дипептидилкарбоксипептидазы
1.3.2.1. Ангиотензинпревращающий фермент
1.3.3. Карбоксипептидазы
1.3.3.1. Карбоксипептидаза И

1.3.3.2. Карбоксипептидаза Б
1.3.3.3. КарбоксипептидазаМ
1.3.3.4. Карбоксипептидаза Ъ
1.3.4. Трипептидиламинопептидазы
1.3.4.1. Трипептидиламинопептидаза
1.3.5. Дипептидиламинопептидазы
1.3.5.1. Дипептидиламинопептидаза III
1.3.5.2. Дипептидиламинопептидаза IV
1.3.6. Аминопептидазы
1.3.6.1. Лейцинаминопептидаза
1.3.6.2. Аланинаминопептидаза
1.3.6.3. Аминопептидаза В
1.3.6.4. Аминопептидаза М
1.3.6.5. Аминопептидаза А
1.3.6.6. Пироглутамил-аминопептидаза
1.3.6.7. Аминопептидаза Р
1.3.7. Трипептидаза
1.3.8. Дипептидазы
1.3.8.1. Глицилглициндипептидаза
1.3.8.2. Глициллейциндипептидаза
1.3.8.3. Карнозиназа
1.3.8.4. Пролидаза
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материал и условия проведения исследований
2.2. Методы получения клеточных, субклеточных и суборгано-идных структур мозга
2.2.1. Метод получения обогащенных фракций нейронов и глии
2.2.2. Метод получения субклеточных фракций мозга

2.2.3. Метод получения очищенных митохондрий
2.2.4. Метод получения субмитохондриальных фракций
2.3. Методы выделения и очистки протеолитических ферментов
из мозга животных
2.3.1. Методы выделения и очистки карбоксипептидазо-В-подобных ферментов
2.3.1.1. Метод выделения, очистки мембраносвязанных карбоксипептидазо-В-подобных ферментов
2.3.1.2. Метод выделения и очистки растворимой формы карбоксипептидазы Н
2.3.1.3. Метод выделения и очистки растворимой формы ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
2.3.2. Метод выделения и очистки растворимой формы ами-нотрипептидазы
2.3.3. Метод выделения и очистки мембранносвязанной аминопептидазы
2.3.4. Метод выделения и очистки глицилглициндипеп-
т ид азы
2.3.4.1. Исследование множественности молекулярных
форм глицилглициндипептидазы
2.4. Метод выделения и очистки низкомолекулярного термостабильного ингибитора карбоксипептидазо-В-подобных ферментов
2.5. Физико-химические методы анализа свойств протеолитических ферментов мозга и их специфичности действия
2.5.1. Исследование молекулярной гетерогенности пептид-
гидролаз нервной ткани с использованием электрофореза в ПА АГ

NEP проявляет максимальную активность при pH около 7,0 и является Zn21-зависимой металлоэндопептидазой. Она сильно ингибируется о-фенантролином, ЭДТА, дитиотреитолом, химостатином, фосфатом и NaCl, специфичными ингибиторами тиорфаном и фосфорамидоном и другими синтетическими ингибиторами [97, 98, 99, 124, 194, 196, 373, 381, 428, 443J. N-этилмалеимид, ПХМБ, ФМСФ, аиротинин, пуромицин, бацитра-цин, ингибиторы АПФ каптоприл, SQ 14 225, SQ 20 881 не влияют на её активность [97, 98, 99, 124, 373, 381, 428, 443]. Активность фермента подавляется некоторыми биологически активными пептидами и их фрагментами: Leu-энкефалином (ICso 100 мкМ), Met-энкефалином (1С50 10 мкМ), ангиотензинами I и II (1С5о 100 мкМ), брадикинином (1С50 100 мкМ), Туг-Gly-Gly-Phe (ICso ЮО мкМ) [280]. lie исключено, что in vivo вышеперечисленные пептиды могут участвовать в регуляции активности фермента.
Нейтральная эндопептидаза расщепляет низкомолекулярные пептиды (с молекулярной массой, как правило, не более 3 000 Да, единственное исключение интерлейкин 1(3), состоящие не менее чем из 5 аминокислотных остатков с N-конца гидрофобных аминокислот. Наиболее специфичным субстратом для фермента следует считать flaHciur-Gly-pNCPPhe-PAIa (IGm 37 мкМ) [217], однако не исключено, что и он может расщепляться отличными от NEP эндопептидазами. Эндопептидаза 24.11 in vitro расщепляет различные биологически активные пептиды и их фрагменты с Кт порядка 50-100 мкМ [192, 280, 457].
NEP широко распространена в тканях млекопитающих. Максимальное количество фермента содержиться в почках, примерно в 2 раза меньшее -в семенниках, ещё в 3 раза меньшее - в лимфатических узлах. Содержание фермента в различных отделах кишечника составляет 2-10%, в поджелудочной железе, надпочечниках, аденогипофизе и спинном мозге - около 1% от такового в почках. В отделах головного мозга содержание фермента в 3-10 раз меньше, чем в спинном мозге. Максимальная активность NEP