Разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики раннего иксодового клещевого боррелиоза

• Автор: Иванов, Игорь Диадорович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 146 с. : ил.

Оглавление
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Клещевой боррелиоз
1.1.1. Эпидемиология клещевого боррелиоза
1.1.2. Патогенез и клиника клещевого боррелиоза
1.2. Молекулярно-биологические характеристики спирохет В. burgdorferi sensu lato
1.3. Антигены В. burgdorferi sensu lato
1.3.1. Семейство Osp
1.3.1.1. OspA и OspB
1.3.1.2. OspC
1.3.1.3. OspD
1.3.1.4. OspE и OspF
1.3.2. Другие антигены, кодируемые плазмидными ДНК
1.3.2.1 Декоринсвязывающие белки
1.3.2.2 Высоковариабельные антигены
1.3.3. Антигены, кодируемые хромосомной ДНК.
1.3.3.1. Флагеллярные белки
1.3.3.2. Р83 или Р
1.3.3.3. Р
1.3.3.4. Семейство Вмр
1.3.3.5. Р
1.4. Антигены В. burgdorferi s.l., используемые для диагностики вакцинопрофилактики

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы, реагенты и прочие материалы
2.2. Методы работы с ДНК
2.2.1. Выделение ДНК из кишечника клещей с использованием протеиназы К
2.2.2. Получение суммарного препарата ДНК из клещей с использованием гуанидина-изотиоцианата
2.2.3. Выделение ДНК из кожных покровов уха мелких млекопитающих
2.2.4. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli методом щелочного лизиса
2.2.5. Быстрое выделение плазмидной ДНК из колоний E.coli
2.2.6. Выделение плазмидной ДНК с использованием ионообменной хроматографии
в 2.2.7. Электрофорез ДНК в гелях агарозы
2.2.8. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле
2.2.9. Выделение ДНК из гелей электроэлюцией в ячейках фирмы "ISCO"
2.2.10. Выделение ДНК из агарозного геля методом сорбции на мелкодисперсном диоксиде кремния
2.2.11. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
• 2.2.11. Лигирование фрагментов ДНК с использованием ДНК-
лигазы бактериофага Т
2.2.12. Амплификация ДНК в системе ПЦР
2.2.13. Секвенирование ДНК
2.3. Методы работы с бактериями
2.3.1. Используемые среды и общие приемы
2.3.2. Амплификация низкокопийных плазмид при помощи

хлорамфеникола
2.3.3. Трансформация клеток E.coli
2.3.4 Подготовка бактериальных клеток к длительному хранению
2.4. Методы работы с белками
2.4.1. Выделение рекомбинантных белков
2.4.2. Анализ белков
2.4.3. Иммуноферментный анализ
2.4.4. Окраска иммуноблотов
2.4.4.1. Окраска альфа-нафтолом
2.4.4.2. Анализ нитроцеллюлозных стрипов с помощью ECL
2.4.4.3. Проявление иммуноблотов со вторыми антителами, 73 мечеными золотом
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение зараженности клещей, собранных на территории 74 Сибири
3.2. Конструирование рекомбинантных штаммов E.coli,
продуцирующих антигены, специфичные для циркулирующих в Сибири представителей В. burgdorferi s. 1.
3.2.1. Конструирование рекомбинантного штамма E.coli,
продуцирующего фрагмент флагеллярного белка B.garinii NT
3.2.2. Конструирование рекомбинантного штамма E.coli,
продуцирующего антиген OspC B.garinii NT
3.3. Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики
начальных стадий клещевого боррелиоза у человека
3.3.1. Определение оптимальной концентрации антигена и конъюгата
3.3.2. Определение антител к Borrelia burgdorferi s.l. в сыворотках крови людей

3.3.3. Разработка стрипового варианта иммунохимической тест-
- 15. Кассета расположена вблизи правой теломеры. Транскипционная активность как правило наблюдается в одной из единиц - остальные гены находятся в неактивном состоянии. Количество рекомбинаторных вариантов экспрессируемой единицы (vlsE) - несколько миллионов. Степень различия последовательностей в разных изолятах достигает 40%, что совсем немного уступает степени отличия от vmp-последовательностей В. hermsii - 48% (Kawabata et al., 1998).
В эспрессируемой липопротеиновой молекуле размером около 34 кДа

примерно 75% аминокислотной последовательности является невариабельной -прежде всего концевые фрагменты. Центральная часть устроена сложнее, в ней чередуются консервативные и высоковариабельные регионы (IR|-IR6 и VRr VRs), причем вариабельные домены черезвычайно сильно различаются как по аминокислотному составу, так и по размеру (Liang et al., 1999).
Сильным иммуногенным действием обладают в первую очередь именно изменчивые фрагменты. IR$ - MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGFALK вызывает сильный иммунный ответ и у приматов, и у грызунов, a IR2 -DAASVNGIAKGIKGIVDAA и IR4 - D AGK А А А А V A A VSGEQILKAIVHA А вызывают иммунный ответ у мышей. При боррелиозной инфекции остальные инвариабельные домены VlsE являются крайне слабыми иммуногенами. (Liang and Philipp, 1999). Иммуногенность консервативных доменов VlsE перекликается с расположением доменов на поверхности или внутри бактериальной мембраны (Liang et al., 2000).
Функции данного липопротеина, или точнее группы липопротеинов пока не ясны. Высокая степень (в среднем около 90%) сходства коротких консервативных регионов VlsE в различных геномовидах В. burgdorferi s.L, а также четкая корреляция между вирулентностью штаммов В. burgdorferi и наличием плазмиды, несущей v/j-кассету, указывает на важную физиологическую роль VlsE (Iyer et al., 2000).
Другим семейством плазмидокодируемых липопротеинов является Мір (multicopy lipoproteins (англ)). Гены mlp дислоцированы на кольцевых