Подходы к получению протеолитических антител

• Автор: Воробьев, Иван Иванович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Обзор литературы
Индуцированные абзимы
Природные каталитические антитела
Антиидиотипические антитела
Заключение
Материалы и методы
Химические реактивы и материалы
Базовые методы
Экспрессия рекомбинантных белков в клетках E. coli
Получение рекомбинантных клонов вируса AcMNPV
Аналитическая экспрессия гликопротеина gpl20
Препаративная экспрессия, выделение и очистка гликопротеина gpl20
Подготовка образца для масс-спектрометрии методом MALDI
Триптический гидролиз для масс-спектрометрического анализа
Масс-спектрометрия методом MALD1
Масс-спектрометрический анализ продуктов распада trx-gpl20I-III по
методу SELDI
Синтетический антиген
Иммунизация мышей
Проточная цитофлуориметрия
Выделение и очистка антител
Иммуноферментный анализ
Получение флуоресцентных субстратов gpl20- иммуноблоттинга
Детекция гидролиза рибонуклеазы А антителом 6В8Е12
Результаты
Получение каталитических антител, расщепляющих поверхностный
гликопротеин ВИЧ-1 gpl20
Получение слитных белков на основе фрагментов gpl20 для иммунизации и изучения свойств антител. Прокариотическая экспрессия73
Экспрессия gpl20 в бакуловирусной системе
Каталитические свойства полученных антител
Установление сайт-специфичности протеолитических антител к gpl20

Антиидиотипическое протеолитическое антитело 6В8Е12
Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы
Список сокращений

Сложные химические превращения, регулирующие жизненно важные процессы, в большинстве своем являются каталитическими и происходят при участии высокоспецифичных и эффективных биокатализаторов - ферментов. В последние годы с помощью методов генетической инженерии и направленной химической модификации удалось создать ферменты с измененными свойствами. На этом поиск новых биокатализаторов не прекратился. В ряду каталитически активных молекул особое место занимают рибозимы - каталитические РНК, и абзимы - каталитические антитела.
Антитела представляют собой белковые молекулы, способные взаимодействовать с высокой специфичностью практически со всеми природными или синтетическими антигенами. Разнообразие антител, в отличие от ферментов, практически не лимитировано. По некоторым

подсчетам оно составляет 10 вариантов, что обеспечивает очень широкий репертуар специфических «биополимерных матриц», способных распознавать как низко-, так и высокомолекулярные гаптены. В 1948 году Л. Полинг [1] предположил, что принципиальное различие между антителами и ферментами заключается в том, что первые наиболее специфично взаимодействуют с антигеном в его стабильной конформации (низкоэнергетическом состоянии), тогда как ферменты, наоборот, проявляют максимальную специфичность к высокоэнергетическому переходному состоянию реакции. Таким образом, антитела, узнающие переходное состояние реакции могут проявлять каталитическую активность. В 1969 году Дженкс предложил использовать стабильные аналоги переходных состояний реакций в качестве иммуногенов для получения каталитических антител [2].
Эта идея была экспериментально подтверждена [3] для поликлональных антител к соединениям пиридоксаль фосфата и тирозина в форме восстановленных оснований Шиффа. К сожалению, авторам не удалось
продемонстрировать существенного ускорения. Значительный прогресс в создании абзимов стал возможен после возникновения технологии получения моноклональных антител [4].
Количество реакций, катализируемых антителами, равно как и методик их получения, неуклонно растет. Современная абзимология опирается на синтез разнообразных аналогов переходных состояний реакций, введение кофакторов и каталитических групп в уже существующие антитела, сайт-направленный мутагенез. Большинство известных каталитических антител было получено данными методами, однако, развиваются и альтернативные подходы - получение антиидиотипических антител и реакционная иммунизация.
Метод получения антиидиотипических антител опирается на свойства иммунной системы образовывать антитела “внутреннего образа” и на идиотипическую гипотезу, высказанную в 1974 году Н. Ерни [5]. Первым удачным примером абзима, полученного данным методом, является моноклональное антитело 9А8, связывающее моноклональное антитело, которое в свою очередь связывает активный центр ацетилхолинэстеразы. Было показано, что антитело 9А8 проявляет свойства исходного антигена, то есть обладает ацетилхолинэстеразной активностью [6].
Метод реакционной иммунизации основан на использовании в качестве иммуногена необратимых ингибиторов ферментов. Такие ингибиторы могут образовать стабильный ковалентный комплекс с антителами, катализирующими соответствующую реакцию гидролиза. Этот метод был проверен при успешном отборе рекомбинантных мини-антител, содержащих реакционноспособный остаток цистеина [7] и использован для получения каталитических антител in vivo при иммунизации мышей диалкилфософонатом [8].
Как уже упоминалось, в настоящее время имеются широкие возможности для получения биокатализаторов de novo, основываясь на свойстве гипервариабильности суперсемейства иммуноглобулинов
полученным на активный центр ацетилхолинэстеразы эритроцитов человека (ЕС 3.1.1.7), было отобрано моноклональное антиидиотипическое антитело 9А8, проявляющее ацетилхолинэстеразную активность [6].
Моноклональное антиидиотипическое антитело 9А8 является иммуноглобулином класса IgM. Гидролиз ацетилтиохолина под действием абзима подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Субстратного ингибирования, описанного при гидролизе ацетилхолинэстеразой, в случае гидролиза антителом не наблюдается (рис. 12).
Лсс1у111аос11о1те (тМ)
Рис. 12. Кинетика гидролиза ацетилтиохолина (АТСЬ) моноклональным антителом 9А8 (•) и ацетилхолинэстеразой из человеческих эритроцитов НЕ АсЬЕ (0).
Экспериментальные кривые позволили определить каталитические
параметры реакции (таб. 4).
Катализатор Км, мМ К с’1 кат? ^ Ккат/Км, *10'5М'1с'1 Ккат/Кискат *10'8 К„, мМ
Антитело 9А8 0,60 81 1,35 4,15 -
НЕ АСЬЕ 0,13 8000 615 410
Таб. 4. Кинетические константы гидролиза ацетилтиохолина моноклональным антителом 9А8 и ацетилхолинэстеразой человеческих эритроцитов. Ки - константа ингибирования
субстратом
Как видно из приведенной таблицы, каталитические константы
фермента и абзима отличаются на два порядка, в то время как константы
Михаэлиса в пять раз. Таким образом, абзим имеет меньшее сродство к