Регистрация неравновесных состояний мембраносвязанных ионов водорода в митохондриях и их роль в процессе окислительного фосфорилирования

• Автор: Юрков, Владимир Игоревич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Часть I Обзор литературы
1. Основные этапы развития теории сопряжения процессов дыхания и фосфорилирования
Химическая схема сопряжения
Хемиосмотическая гипотеза Митчелла
Теория Вильямса
Схема Бойера
2. Суперкомплексы дыхательной цепи
Роль липидов в формировании белковых суперкомплексов в мембране митохондрий
Функциональная значимость мембранных дыхательных суперкомплексов
3. Высокий кинетический барьер в реакции отрыва протона от поверхности мембраны
4. Идентификация неравновесных состояний мембраносвязанных состояний мембраносвязанных ионов водорода в модельных системах
5. Латеральный перенос протона вдоль поверхности биологических мембран
Часть II Материалы и методы
Выделение митохондрий из печени крысы
Часть III Результаты и обсуждение

1. Разработка нового метода регистрации неравновесных состояний ионов водорода, связанных с внешней поверхностью внутренней мембраны митохондрий в условиях работы дыхательных Н+-помп
1.1 Препарат ФИТЦ-меченых митохондрий, обладающих фосфорилирующей активностью
1.2 Методика приготовления препарата фосфорилиругощих ФИТЦ-меченых митохондрий и регистрация изменений спектров рН-зонда, возникающих при работе протонных помп
1.3 Свойства препарата ФИТЦ-меченых митохондрий
а) Компоненты и природа наблюдаемого дифференциального спектра поглощения рН-зонда, возникающего при включении работы дыхательных протонных помп в препаратах ФИТЦ-меченых митохондрий
б) О связывании рН-зонда (ФИТЦ) с внутренней митохондриальной
мембраной
1.4 Метод регистрации локальных Н-градиентов в фосфорилирующих ФИТЦ-меченых митохондриях с помощью дифференциальной спектроскопии
2. Разработка метода обнаружения относительно высокого кинетического барьера в реакции отрыва мембраносвязанных ионов водорода на внешней стороне мембраны разобщенных интактных (в условиях работы дыхательных Н+-помп) митохондрий
3. Метод идентификации и химическая природа высокого кинетического барьера в реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности митохондриальной мембраны
3.1 Обнаружение эффекта катализа реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности внутренней мембраны фосфорилирующих митохондрий

4. Экспериментальное исследование неравновесных состояний ионов водорода на мембране митохондрий
а) Регистрация локального Н+-градиента на внутренней мембране митохондрий в состоянии 4 по Чансу и в разобщенных митохондриях
б) Эффект подавления дыхания разобщителем (ПТВ)
в) Обнаружение кинетического барьера в реакции отрыва ГГ1"-ионов от поверхности мембраны митохондрий. (Эффект ускорения разобщенного дыхания митохондрий под влиянием непроникающего катализатора реакции отрыва РГ от внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны)
г) Влияние непроникающих катализаторов с разным химическим строением на скорость отрыва Н+- ионов от внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны
д) О возможном участии транслокатора адениновых нуклеотидов в процессе ускорения разобщенного дыхания катализаторами реакции отрыва ионов водорода
е) Регистрация образования неравновесных состояний мембраносвязанных ионов водорода на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны с помощью ФИТЦ-зонда. В условиях фосфорилирования
ж) Интактные митохондрии (не меченые ФИТЦ). Положительная корреляция между величиной пула мембраносвязапных ионов водорода, величиной параметра АОР/О и скоростью фосфорилирующего дыхания
Заключение
Выводы
Благодарности
Приложение
Литература

мембрана-вода в 3-5 раз ниже, чем в воде и было сделано предположение, что чем ниже диэлектрическая постоянная, тем выше величина межфазного барьера (Cherepanov et ah, 2003,).
Хотя строгое физическое описание природы барьера на границе раздела фаз до сих пор остается неполным, его свойства могут быть определены из экспериментальных данных. В частности, перенос протона через потенциальный барьер на границе раздела фаз характеризуется слабой pH-зависимостью и высокой энергией активации порядка 30-50Дж/моль (Heberle, 1990). Как отмечено в работе (Gopta et al., 1990), эти особенности указывают на участие нейтральной воды как промежуточного переносчика протона. По-видимому, из-за потенциального барьера протоны/гидроксилы и/или молекулы pH-буфера не успевают диффундировать из объемной водной фазы к достигающим поверхности «свежим» протонам/протонным вакансиям, прежде чем последние провзаимодействугот с молекулами нейтральной воды. Нужно иметь ввиду, что несмотря на обилие воды, активационный барьер для ее
протонирования/депротенирования составляет 50 кДж/моль при нейтральном pH.
Для выявления свойств потенциального барьера на границе раздела фаз были проанализированы факторы, определяющие скорость протонной релаксации на поверхности сферических мембранных везикул при наличии потенциального барьера. С этой целью была система соответствующих диффузионных уравнений, и решение было сопоставлено с экспериментальными данными. Моделирование показало, что скорость протонного обмена между мембранной поверхностью и объемной водной фазой определяется буферной емкостью поверхности, высотой потенциального барьера и размером везикул (Cherepanov et al., 2004). Рассчитанная зависимость скорости протонного обмена от размера соответствовала экспериментальным данным. А именно, рядом авторов (Junge et al., 1986) было показано, что гидрофильные pH-индикаторы отвечали на выброс