Молекулярные механизмы регуляции активности цитохромов Р450 подсемейства 1А в печени крыс при воздействии на организм холода

• Автор: Перепечаева, Мария Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 136 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Система биотрансформации ксенобиотиков
1.1.1. Общая характеристика системы биотрансформации ксенобиотиков
1.1.2. Суперсемейство цитохромов Р450
1.1.3. Подсемейство цитохромов Р450 1А
1.2. Арилгидрокарбоновый рецептор
1.2.1 Суперсемейство генов ядерных рецепторов
1.2.2. Структура, функция и сигнальный путь АЖ
1.2.3. Регуляция сигнального пути арилгидрокарбонового рецептора
1.2.4. Роль протеинкииаз в регуляции сигнального пути арилгидрокарбонового рецептора
1.2.5. Роль протеосом в процессе деградации АЖ
1.3. Индукция СУР1А без участия “классических” лигандов АЖ
1.3.1. Эндогенные индукторы и модуляторы СУР1А1
1.3.2. Билирубин
1.3.3. Витамин Е (а-токоферол)
1.3.4. Кортикостерон
1.4. Биологические эффекты холодового фактора
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы
2.2. Животные
2.3. Методы исследования
2.3.1. Выделение микросом и цитозолей печени крыс
2.3.2. Определение количества белка в микросомах и цитозолях
2.3.3. Определение количества цитохромов Ь5 и Р450 в микросомах печени крыс
2.3.4. Определение активности НАДФН-цитохром Р450 редуктазы в микросомах печени крыс
2.3.5. Определение активности глутатион-8-трансферазы в цитозоле печени крыс
2.3.6. Определение активностей СУРІАІ и СУР1А2 в микросомах печени крыс
2.3.7. Количественное определение малонового диальдигида
2.3.8. Определение токоферолов в микросомах печени крыс
2.3.9. Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ

2.3.10. Полусухой электроперенос беков на нитроцеллюлозную мембрану
2.3.11. Иммунохимический анализ белков микросом
2.3.12. Иммунохимический анализ белков цитозоля
2.3.13. Выделение суммарной клеточной РНК
2.3.13.1. Выделение суммарной клеточной РНК ДСН-фенольным методом
2.3.13.2. Выделение суммарной клеточной РНК набором фирмы Вектор-Бест .'
2.3.14. ДНКазная обработка
2.3.15. Электрофорез РНК в частично денатурирующих условиях
2.3.16. Определение концентрации РНК
2.3.17. Определение уровня мРНК СУР1А1, СУР1А2, АИР, Ат1, А ИКР, Нэр90, ТТР
2.3.17.1. Обратная транскрипция
2.3.17.2. Полимеразная ценная реакция
2.3.17.3. Анализ продуктов ПЦР
2.3.18. Выделение экстракта ядер клеток печени
2.3.19.0пределение белка в экстрактах ядер
2.3.20. Приготовление зонда для ДНК/белкового связывания
2.3.20.1. Мечение олигонуклеотида
2.3.20.2. Очистка олигонуклеотида
2.3.21. Анализ ДНК/белковых комплексов
2.3.22. Определение активностей протеосом
2.3.23. Определение количества карбонильных групп
2.3.24. Определение общего и конъюгированного билирубина
2.3.25 Определение уровня кортикостерона
2.4. Статистическая обработка
Глава 3. Результаты
3.1. Характеристика метаболических процессов у крыс при длительном воздействии умеренно низкой температуры (модель Харта)
3.2. Характеристика микросомальной монооксигеназной системы печени крыс при холодовом воздействии
3.3. Исследование уровней мРНК СУР!А1 и СУР1А2 и апоферментов СУР1А1 и СУР! А2 в печени крыс при холодовом воздействии
3.4. Исследование активности протеосом при холодовом воздействии
3.5. Исследование влияния холода на экспрессию основных компонентов АЫ1-сигнального пути
3.6. Исследование влияния ингибиторов ТК на активность СУР1А на фоне холодового воздействии
3.7. Исследование влияния холода на ДНК-связывающую способность АИИ. в печени крыс
3.8. Исследование содержания токоферола в печени и билирубина в сыворотке крови крыс под действием холода
Глава 4. Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы

et al., 2004). В клетках I-IepG2 человека и Нера-1 мыши гербимицин А ингибирует экспрессию CYP1A1 под действием альфа-нафтофлавона и омепразола (Kikuchi H. et al., 2002). При воздействи ТХДД на клетки HepG2 человека, как и на клетки первичной культуры гепатоцитов крыс изменений мРНК CYP1A1 не выявлено (Vogel
C. et al., 2000; Kikuchi H. et al., 2002).
Селективный ингибитор TK семейства Scr гелданамицин ингибирует активность CYP1A1 при действии бензопирена на клетки RTL-W1 печени форели (Schirmer K. et al., 2000). В клетках Нера-1 мыши и HepG2 человека гелданамицин усиливает накопление AhR в ядре, но на фоне воздействия ТХДД не вызывает изменений ДНК-связьтвающей активности AhR и вызывает уменьшение апофермента CYP1A1 (Song Z., Pollenz R.S. 2002). При воздействии бета-нафтофлавона на первичную культуру гепитоцитов форели воздействие гелданамицином вызывало уменьшение мРНК CYP1A1.
Таким образом, гербимицин А и гелданамицин во всех случаях уменьшали или не изменяли индукцию CYP1A1 на уровне либо активности, либо мРНК CYP1A1, либо количества белка CYP1A1. Генистеин как усиливал, так и ослаблял индукцию CYP1A1 на разных уровнях регуляции экспрессии и в различных исследуемых линиях клеток.
Практически все имеющиеся литературные данные о влиянии ингибиторов ТК на индукцию CYP1A1 получены in vitro, за исключением работы, в которой крыс кормили экстрактом сои, содержащей генистеин. Возможно, неоднозначность эффекта генистеина объясняется неспецифичностью его воздействия на ТК в сочетании с большим разбросом условий экспериментов.
1.2.5. Роль протеосом в процессе деградации AhR
Существует два пути внутриклеточной деградации белков - лизосомальная система, преимущественно осуществляющая протеолиз белков, подвергающихся эндоцитозу, и убиквитин-протеосомная система, являющаяся основной (Grüne Т. et al., 1997). Ферментом, катализирующим финальный шаг убиквитин-протеосомного пути, является 26S протеосома, представляющая собой мультисубъединичный