Биосенсоры на основе иммобилизованной пероксидазы для определения пероксида водорода

• Автор: Преснова, Галина Васильевна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА I. МЕТОДЫ ОРИЕНТИРОВАННОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ
1.1 Методы иммобилизации белков на поверхности твердых носителей
1.2 Методы иммобилизации белков на золоте
1.3 Методы ориентированной иммобилизации белков
ГЛАВА II. СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА
2.1 Классификация и общая характеристика пероксидаз
2.2 Структура изофермента С пероксидазы хрена
-** *'.> ' * :• ‘ V
2.3 Каталитический цикл псроксидазндйреакции. ,
2.4 Методы детекции пероксидазы хрена
ГЛАВА III. БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА.
3.1 Биосенсоры для определения пероксида водорода
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1 Материалы
4.2 Методы исследования
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 5
ГЛАВА V. ИЗУЧЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ИММОБИЛИЗАЦИИ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА НА ПОВЕРХНОСТИ ПОРИСТЫХ МЕМБРАННЫХ НОСИТЕЙ
5.1 Выбор способов иммобилизации пероксидазы хрена на пористых носителях.

5.2 Изучение закономерностей реакции усиленной хемилюминесценции на поверхности мембранных носителей.
5.3 Сравнительное изучение ферментативной активности пероксидазы хрена, иммобилизованной различными методами.
5.4 Определение концентрации фермента на поверхности мембранных носителей
ГЛАВА VI. ОРИЕНТАЦИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА НА ПОВЕРХНОСТИ ЗОЛОТА ЧЕРЕЗ ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ
6.1 Получение фрагментов антител со свободной тиоловой группой
6.2 Сравнительное изучение электрохимической и хемилюминесцентной активности пероксидазы, иммобилизованной на поверхности золота через фрагменты антител.
6.3 Определение кинетических и равновесных констант взаимодействия пероксидазы с иммобилизованными фрагментами моноклональных антител.
ГЛАВА VII. ИММОБИЛИЗАЦИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА НА ПОВЕРХНОСТИ ЗОЛОТА
7.1 Иммобилизация различных форм пероксидазы на поверхности золота
7.2 Кинетические характеристики различных типов пероксидаз, иммобилизованных на поверхности золотого электрода.
ГЛАВА VIII. БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ
8.1 Биосенсоры для определения пероксида водорода на основе иммобилизованной пероксидазы.
8.2 Основные аналитические характеристики различных групп биосенсоров для определения пероксида водорода.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
Определение концентрации пероксида водорода очень важно в различных областях, включая косметическую промышленность, медицину, контроль окружающей среды и т.д. Перекисные соединения могут образовываться в организме как при развитии патологических процессов, так и при проведение некоторых лечебных процедур, изменяющих равновесие метаболических процессов. Наряду с перекисными соединениями, различные токсины могут легко проникать в клетку через их окислительное воздействие на белки, мембраны и ДНК и вызывать разрушение здоровых клеток. Образование пероксида как промежуточного продукта может быть использовано для определения целого ряда биологически активных соединений (глюкоза, лизин, глутамат и др.) через сопряженные полиферментные системы. Определение пероксида водорода важно и при экологическом мониторинге. Это связано с ростом атмосферных загрязнений и разрушением озонового слоя. Поэтому пероксид водорода необходимо определять в достаточно широком диапазоне концентраций.
За последнее время все большее внимание уделяется ферментным биосенсорам. Это связано с высокой селективностью ферментов высокой чувствительностью таких методов. Пероксидаза хрена является одним из наиболее часто используемых в аналитических целях ферментом. Пероксидазу применяют как метку в иммуноанализе и в методе ДНК-зондов, в аналитических целях для определения широкого круга физиологически активных соединений. Использование пероксидазы в качестве метки и условия ее детекции в методах иммуноанализа достаточно хорошо изучены. Одним из подходов для использования пероксидазы для целей аналитической биохимии является иммобилизация фермента, так как она позволяет увеличить стабильность фермента и обеспечить его многоразовое использование. Пористые мембранные носители являются перспективными для иммобилизации различных белков, так как обладают большой удельной поверхностью и высокой механической прочностью. Они находят применение, в том числе и для методов иммуноанализа. На практике возникает потребность проведения высокочувствительного, по при этом быстрого и несложного в выполнении анализа для различных целей, например, для анализа объектов

постулирован путь увеличения интенсивности свечения через реакцию радикалов усилителя с люминолом. Авторы другой работы [78], в которой были проанализированы Гамметовские корреляции усиливающих и не усиливающих фенолов и рН-зависимости констант скоростей их окисления на ферментативных стадиях, также склоняются к неферментативной природе усиливающего эффекта.
Производные фенолов в реакции усиленной хемилюминесценции могут быть как усилителями, так и ингибиторами люминесценции. Существует прямая связь между окислительно-восстановительными свойствами производного фенола, его значениями рК и тем, будет ли он усиливать или ингибировать люминесценцию в системе люминол-перексид водорода-пероксидаза [79-81].
В результате изучения ингибирующего эффекта фенолов на усиленную хемилюминесценцию в присутствии п-йодфенола авторы пришли к выводу о том, что уменьшение интенсивности хемилюминесценции вызвано не конкуренцией между п-йодфенолом и другим фенолом за промежуточные соединения фермента I и II, но, наиболее вероятно, вызвано конкуренцией между другим фенолом и люминолом за феноксильные радикалы п-йодфенола [82].
Наиболее общее исследование механизма усиления в реакции усиленной хемилюминесценции было проведено в работе [83]. Авторы изучили ряд фенолов с целью нахождения корреляции между их термодинамическими свойствами, их способностью окисляться соединениями I и II пероксидазы и эффектом усиления. В результате было показано, что для разных фенолов механизм усиления разный. Часть фенолов окисляется соединениями I и II пероксидазы значительно быстрее люминола, что приводит к увеличению скорости ферментативной части реакции окисления. С другой стороны, методом импульсного радиолиза было показано, что феноксильные радикалы способны окислять люминол. Эта реакция является обратимой. Следовательно, производные фенолов, образующие радикалы с низким окислительно-восстановительным потенциалом, будут реагировать с радикалами люминола, и, таким образом, тушить люминесценцию. Те же фенолы, которые образуют феноксильные радикалы с высоким окислительно-восстановительным потенциалом, будут увеличивать концентрацию радикалов люминола путем реакции обмена радикалом. Однако эти вещества вследствие высокого окислительно-восстановительного потенциала радикалов медленнее окисляются