Биологические свойства и гибридизационная способность ген-направленных реагентов на основе дуплекс- и триплексобразующих олигонуклеотидов

• Автор: Максименко, Андрей Викторович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список условных сокращений
Введение
I. Системы-носители для доставки олигонуклеотидов в клетки (Обзор литературы).
1.1. Пептидные и белковые конструкции для доставки
олигонуклеотидов в клетку.
1.2. Липосомальный транспорт.
1.3. Вирусная доставка олигонуклеотидов в клетки.
1.4. Транспортные системы на основе наночастиц.
1.5. Водорастворимые поликатионные носители.
1.6. Дендримерные частицы в качестве носителей олигонуклеотидов.
II. Биологичексие свойства и гибридизационная способность ген-направленных реагентов на основе дуплекс- и триплексобразующих олигонуклеотидов (Обсуждение результатов).
11.1. Биологические и физико-химические свойства антисмысловых олигонуклеотидов различной пространственной структуры.
II. 1.1. Дизайн олигонуклеотидных конструкций.
II. 1.2. Доставка олигонуклеотидов в клетки с помощью дендримера 8ирегРес1™.
II. 1.3. Изучение гибридизации структурированных ОДН с ДНК- и РНК-мишенями методами УФ-спектроскопии и электрофореза в неденатурирующих условиях.
II. 1.4. Гидролиз 31-звенной РНК-матрицы РНКазой Н в составе

II. 1.4. Гидролиз 31-звенной РНК-матрицы РНКазой Н в составе дуплекса с ОДН.
II. 1.5. Изучение влияние длины мРНК на эффективность гибридизации со структурированными ОДН методом переноса энергии флуоресценции.
II. 1.6. Устойчивость к ферментативному гидролизу ОДН различной вторичной структуры в присутствии и в отсутствие ЗирегРеЩ™.
II. 2. Образование бимолекулярных триплексов с РНК, содержащей короткие
полипуриновый и полипиримидиновый фрагменты.
П.2.1. Определение ориентации Хугстиновской цепи в триплексе.
11.2.2. Синтез циклических олигонуклеотидов.
11.2.3. Изучение образования триплексов циклическими олигонуклеотидами с ДНК- и РНК-матрицами методом УФ-спектроскопии.
11.2.4. Изучение образования триплексов линейными ОДН с ДНК- и РНК-матрицами методом электрофореза в неденатурирующих условиях.
11.2.5. Изучение образования триплексов линейными ОДН с ДНК- и РНК-матрицами спектроскопией кругового дихроизма.
III. Экспериментальная часть.
III. 1. Реактивы и материалы.
ІІІ.2. Методы.
Ш.З. Синтезы.
ІІІ.4. Гибридизация структурированных и триплексобразующих олиго-

нуклеотидов с ДНК- и РНК-мишенями
111.5. Устойчивость ОДН различной пространственной структуры к нуклеазному

гидролизу в биологических средах.
111.6. Синтез фрагментов мРНК белка оболочки вируса Friend
Выводы
Литература

флуоресцеина (Г-21Ь и Р-8Ь, соответственно). Поскольку эффективность проникновения ОДН через цитоплазматическую мембрану определялась по интенсивности внутриклеточной флуоресценции, то необходимо было предварительно изучить гидролитическую устойчивость
флуоресцентномеченных ОДН и выяснить связана ли внутриклеточная флуоресценция с флуоресценцией олигонуклеотидного производного ИЛИ с флуоресценцией свободного флуоресцеина, образовавшегося в результате ферментативного гидролиза ОДН. Поскольку структурированные химерные сс-р ОДН значительно более устойчивы к нуклеазной деградации, чем линейные природные [105], в первую очередь была изучена устойчивость ¥-21Ь в исследуемых типах клеток. С этой целью его комплекс с БирегРеН™ инкубировался с клетками N11-1 ЗТЗ и НеРа в течение 16 часов, затем клетки тщательно промывались, проводился их лизис и выделение флуоресцентных продуктов. На рис. 6 представлен электрофоретический анализ нуклеазной деградации Г-21Ь в клетках.
Рис. 6. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза Р-21Н в клетках МН ЗТЗ (дорожка 2) и НеЬа (дорожка 3) после его инкубации в течение 16 часов в составе комплекса с ЗирегРеН™. Дорожка
ИСХОДНЫЙ ¥-21¥
Как видно из этого рисунка, линейный ОДН с двумя остатками флуоресцеина на концах в составе комплекса с ЗиреіНесІ™ достаточно устойчив к ферментативному гидролизу в обоих типах клеток. Поскольку химерные а-[3 ОДН значительно устойчивее линейных [105], гидролиз не изучался.
Полученные результаты показали, что по изменению флуоресценции в клетках можно судить об эффективности проникновения ОДН. Методом флуоресцентной микроскопии было установлено минимальное количество