Лазерная спектроскопия фотоиндуцированной конформационной динамики биолюминесцентной системы люцифераза-люциферин

• Автор: Чередникова, Елена Юрьевна
• Шифр специальности: 01.04.21
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 148 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава 1. Флуоресцентная и абсорбционная спектроскопия в исследовании динамики биомолекул (обзор литературы)
§ 1. Метод флуоресцентной спектроскопии
§ 2. Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением
§ 3. Спектроскопия наведенного поглощения
§ 4. Спектроскопия биолюминесцентной системы
люцифераза-люциферин
Заключение к главе
Глава 2. Методика измерений и обработки результатов
§2Л. Описание экспериментальной установки
§2.2. Оценка возможного влияния лазерного излучения
на исследуемые образцы
§2.3. Обработка кинетик затухания флуоресценции
§2.4. Регистрация и обработка стационарных спектров флуоресценции
§2.5. Измерение спектров наведенного поглощения
§2.6. Методика приготовления образцов
Основные результаты главы
Глава 3. Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением
белка люциферазы
§ 1. Динамические свойства белковой матрицы люциферазы ;
§ 2. Тушение собственной триптофановой флуоресценции люциферазы лигандами как метод регистрации конформационных изменений белка
3.2.2. Взаимодействие люциферазы с люциферином
3.2.2.Взаимодействие люциферазы с АТФ
Основные результаты главы
Глава 4. Флуоресцентная спектроскопия и спектроскопия наведенного
поглощения люциферина
§ 1. Влияние микроокружения на спектрально-кинетические
свойства люциферина
§ 2. Фотоиндуцированная динамика возбужденного состояния
молекулы люциферина
Основные результаты главы
Глава 5. Фотоиндуцированная конформационная динамика
комплекса люцифераза-люциферин
§ 1. Общая постановка эксперимента по схеме накачка-зондирование ...114 § 2. Теоретическая оценка ожидаемого эффекта
и оптимизация экспериментальной схемы
§ 3. Фотоиндуцированное разгорание триптофановой
флуоресценции фермента
Основные результаты главы
Заключение
Литература
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
Быстрое развитие лазерной техники в последние десятилетия повлекло за собой появление множества направлений в химии, биологии и медицине, в которых методы лазерной физики незаменимы для решения широкого круга исследовательских и прикладных задач. Одним из таких направлений является лазерная спектроскопия биологических макромолекул [1]. Исследование быстрой конформационной динамики белков является одной из важнейших задач при изучении биологических молекул, поскольку их функциональная активность, по-видимому, тесно связана с конформационными изменениями. Это обстоятельство является следствием определенной внутримолекулярной организации белков, отличающей их от случайной конфигурации атомов, подчиняющейся только статистическим закономерностям.
Биомолекулы являются сложными колебательными системами, функционально направленные конформационные перестройки в которых можно уподобить работе механизма или машины, где взаимное перемещение отдельных частей носит направленный характер. Характерные времена многих важных внутримолекулярных превращений белковых молекул лежат в субнаносекундном диапазоне [2]. Методы лазерной спектроскопии и использование сверхкоротких лазерных импульсов позволяют получить непосредственную информацию о такого рода внутримолекулярной подвижности биомолекул.
В природных системах внутримолекулярные процессы происходят случайным образом. Разфазировка между отдельными молекулами в ансамбле приводит к тому, что при попытке зарегистрировать конформационную динамику мы будем наблюдать усредненную по всем молекулам ансамбля картину. Использование импульсных лазерных источников позволяет индуцировать сихронизированные конформационные изменения всех молекул в исследуемом образце, и отслеживать динамику изменений в реальном времени. Кроме того, перевод значительной части молекул исследуемого образца в неравновесное состояние невозможен без использования световых потоков высокой интенсивности. Хорошо известно, что только лазерные системы способны

связывании дегидрогеназы с лигандом аурамином наблюдалось тушение триптофааовой флуоресценции [11]. Дегидрогеназа состоит из двух больших доменов и содержит в своем составе два триптофановых остатка. Кинетика затухания триптофановой флуоресценции дегидрогеназы в присутствии ненасыщающей концентрации аурамина является трехэкспоненциальной, причем средняя и длинная компоненты такие же, как для чистого белка. Появление короткое компоненты связано с тушением средней компоненты, которая приписывается внутреннему триптофановому остатку. Предэкспоненциальный множитель перед длинной компонентой, определяемой внешним триптофановым остатком, при связывании с аурамином уменьшается при насыщении активного центра, что предполагает статическое тушение, возможно, вследствие конформационных изменений. Однако, спектры флуоресцении триптофана и поглощения аурамина перекрываются, поэтому в данном случае также возможно тушение флуоресценции фермента, обусловленное эффективным переносом энергии с внешнего триптофана на аурамин. При этом время затухания флуоресценции внешнего триптофанового остатка может оказаться слишком коротким, чтобы его можно было зарегистрировать, вследствие чего предэкспоненциальный множитель перед длинной компонентой уменьшается по мере того, как все больше молекул фермента связываются в комплекс с аурамином.
Очень часто, несмотря на то, что существуют данные рентгеноструктурного анализа свободного белка, участок связывания с субстратами остается неизвестным. В этом случае обычно нельзя с уверенностью сказать, что же именно привело к тушению триптофановой флуоресценции - прямой контакт лиганда с триптофановым остатком, или изменившееся в результате конформационной перестройки белковой глобулы окружение триптофана. Так, при связывании белка С-трансферазы, содержащей единственный триптофановый остаток Тгр21, с лигандами наблюдается сильное тушение триптофановой флуоресценции [61]. Авторы затрудняются сделать окончательный вывод о причинах тушения, однако более склоняются к тому, что тушение отражает конформационные изменения белковой глобулы в целом.