Рентгентоструктурное исследование эндонуклеазы из Serratia marcescens при разрешении 1.1 А

• Автор: Лунин, Владимир Владимирович
• Шифр специальности: 01.04.18
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава I. Литературный обзор
L1. Нуклео деполимер азы (классификация, функции)
1.2. Объект исследования
1.2.1. Эндонуклеаза из Serratia marcescens - источник, биохимические
характеристики, первичная последовательность
1.2.2. Семейство нуклеаз, гомологичных нуклеазе Sm
1.2.3. Сайт-направленный мутагенез нуклеазы Sm
1.3. Магний как металл кофактор
1.4. Пространственная структура нуклеазы Sm по литературным
данным
1.5. Пространственная структура специфической нуклеазы -Рро
по литературным данным
1.6. Уточнение атомных структур
1.6.1. Традиционное уточнение
1.6.2. Максимизация правдоподобия
1.6.3 Стратегия максимизации правдоподобия
I.6.4. Связь традиционного и МП-уточнения
Глава II. Кристаллизация и предварительное рентгеноструктурное
исследование эндонуклеазы Sm
II.1. Получение и выделение трех изоформ эндонуклеазы Sm

11.2. Кристаллизация эндонуклеазы Sm
11.3. Предварительное рентгеноструктурное исследование
эндонуклеазы Sm
Глава III. Уточнение структуры нуклеазы Sm
III. 1. Уточнение структуры на разрешении 1.7 Ä
III.2. Уточнение структуры на разрешении 1.1 Ä
Глава IV. Анализ структуры нуклеазы Sm
IV. 1. Сравнение положения атомов в структурах, уточненных
на 1.7 Ä и 1.1 А
IV.2. Упаковка молекул в кристалле
IV.2. Анализ карты Рамачандрана
IV.3. Анализ элементов вторичной структуры
уточненной модели
IV.4. Описание активного центра ВО
Г лава V. Механизм действия нуклеазы Sm
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
Благодарности
ЛИТЕРАТУРА
Приложение 1. Список использованных сокращений
Приложение 2. Характеристики набора дифракционных данных 1.1 Ä
Приложение 3. Проверка стереохимических параметров модели 1.1 А

ВВЕДЕНИЕ
Ферменты метаболизма нуклеиновых кислот и, в частности, нуклеодеполимеразы играют ключевую роль в жизнедеятельности клеток в процессах реализации генетической информации. Нуклеодеполимеразы обладают рядом регуляторных функций, находят широкое распространение в биохимии в качестве инструментов генетической инженерии и являются объектом биотехнологического производства, что обусловлено перспективностью их использования в качестве лечебных противовирусных и противоопухолевых препаратов и химических реагентов. Знание структурной организации этих ферментов необходимо для понимания механизмов процессов, осуществляемых нуклеодеполимеразами.
Нуклеодеполимеразы могут быть разделены на дезоксирибонуклеазы (ДНКазы), рибонуклеазы (РНКазы) и нуклеазы. Нуклеазы - ферменты, не проявляющие специфичности к химической природе углеводного компонента нуклеиновых кислот, гидролизующие как дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), так и рибонуклеиновые кислоты (РНК). ДНКазы расщепляют ДНК, РНКазы активны в отношении РНК. В современной литературе накоплено достаточно много разнообразных данных о пространственной структуре и механизме действия РНКаз и ДНКаз, однако до сих пор детально исследованы лишь немногие нуклеазы. Объектом нашего исследования является внеклеточная эндонуклеаза патогенной грамогрицательной бактерии Serratia marcescens (нуклеаза Sm, КФ 3.1.4.9). Этот фермент интересен прежде всего своей универсальностью в отношении расщепляемых им нуклеиновых кислот. Нуклеаза Sm расщепляет без видимого предпочтения одно- и двуцепочечные дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), рибонуклеиновые кислоты (РНК), гибридные молекулы, состоящие из одной цепи

1.5. Пространственная структура специфической нуклеазы -Ppol по литерату рным данным
Недавно была опубликована структура высокоспецифичной метатл-зависимой эндонуклеазы -Рро из РЬузагит ро1усерИа1ит [70]. Фермент принадлежит к семейству нуклеаз. которые в процессе выполнения своей биологической функции производят сайт-специфичный двухнитевой разрез ДНК, оставляя фосфат на 5’-конце. Распознаваемый ферментами злого семейства участок обычно велик (14-44 пар оснований [70]).
Рис. 10. Комплекс димера нуклеазы 1-Рра1 с фрагментом двухнитевой ДНК в качестве субстрата. Рисунок выполнен программой YebLabViewer по данным структуры из РОВ (1а73).