Исследование мутагенеза химерного гена Р53, индуцированного канцерогеном аристолохиевой кислотой, в клетках гуманизированных мышей Hupki

• Автор: Неделько, Татьяна Николаевна
• Шифр специальности: 14.00.14
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 109 с. : ил.

1.1. Ген р и его связь с развитием опухолей.

1.1.1. р история изучения

1.1.2. Молекулярная организация гена и белка р.

1.1.3. Мутации гена р при канцерогенезе и в опухолях.

1.1.4. Функции белка р и последствия их нарушения при канцерогенезе

1.2. Характеристика гуманизированной линии генетически модифицированных мышей НиркК содержащих экзоны с 4го по 9й гена человека.

1.3. Аристолохиевая кислота генотоксический и канцерогенный эффект.

1.4. Заключение

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Получение гомозиготной Нирк1р,0Р, и гетерозиготной Нирк

линий мышей
2.2. Генотипирование мышей Нирк1.
2.2.1. Получение геномной ДНК.
2.2.2. Генотипирование мышей Нирк и мышей дикого типа 9Бу посредством ПЦР с двумя наборами праймеров
2.2.3. Генотипирование и определение полиморфизма го кодона
аллелей гена р мышей Нирк1 с помощью рестрикционных энзимов
2.2.4. Генотипирование мышей Нирк1 по аллелям гена р человека с помощью ПЦР и секвенирования.
2.3. Получение первичных фибробластов эмбрионов мышей Нирк1р,Рго
и Нирк1Агд,рго, а также иммортализованных клеточных линий
2.4. Инкубация первичных культур фибробластов мышей Нирк1РгоРго
и Нирк1А,9Рго с аристолохиевой кислотой.
2.5. Схема эксперимента
2.6. Определение аддуктов ДНК
2.7. Анализ мутаций гена р.
2.8. Определение делеций экзонов гена р в иммортализованных клеточных линиях мышей i.
2.9. Определение присутствия белков р и р в фибробластах гуманизированных мышей i,0, и i9.
2.9.1. Электрофорез белков
2.9.2. Иммуноблоттинг.
2 Статистический анализ
Глава 3. Результаты собственных исследований.
3.1. Характеристика полученных линий мышей i, эмбрионов мышей
и первичных культур эмбриональных фибробластов
3.2. Рост эмбриональных фибробластов мышей i в культуре и влияние
на него аристолохиевой кислоты
3.3. Характеристика аддуктов ДНК, образующихся после инкубации первичных культур эмбриональных фибробластов с аристолохиевой
кислотой.
3.4. Характеристика спонтанных мутаций химерного гена р экзоны
в контрольных клеточных линиях мышей i
3.5. Характеристика мутаций химерного гена р экзоны , индуцированных аристолохиевой кислотой i vi в
эмбриональных фибробластах мышей i
3.6. Характеристика мутаций химерного гена р экзоны , индуцированных аристолохиевой кислотой i vi в
эмбриональных фибробластах мышей i
3.7. Сравнение мутагенного эффекта аристолохиевой кислоты в гомозиготных и гетерозиготных фибробластах мышей i .
3.8. Делеции гена в контрольных и экспериментальных клеточных линиях эмбриональных фибробластов мышей i .
3.9. Исследование присутствия белков р и в полученных клеточных линиях фибробластов мышей i .
Глава 4. Обсуждение результатов исследования.
Выводы.
Список литературы


Клетка в нормальном состоянии имеет небольшое количество белка р, который, однако, играет для нее ключевую роль, а именно как только клетка подвергается стрессу или вредному воздействию, концентрация этого белка резко возрастает. Различные клеточные стрессы както нехватка кислорода, экспрессия онкогенов или вирусная инфекция, усиливают биологическую активность р, то же самое происходит при повреждениях генома Vi В. Например, во время пребывания на солнце, когда ультрафиолетовые лучи оказывают чрезмерное воздействие на геном клеток кожи, происходит активация р, что приводит к развитию двух вариантов клеточного ответа. Вариант первый белок р задерживает деление клеток и они получают возможность восстановить поврежденную ДНК. После устранения изменений в структуре ДНК, блокада клеточного цикла снимается и клетки продолжают деление. Вариант второй если восстановление генома невозможно, то р индуцирует программируемую гибель клетки, инициируя механизм апоптоза. Таким образом, благодаря р, клетки, содержащие поврежденную ДНК, прекращают делиться и не передают мутации дочерним клеткам. Такие качества, спасительные для нашего организма, поззолили назвать белок р хранителем генома , . Ген р обнаружен только в геноме позвоночных организмов. Как следует из названия, белок р имеет молекулярную массу кД установленную по электрофоретической подвижности белка в полиакриламидном геле. Как отмечалось выше, гены мыши и человека секвенированы и локализованы 8оЬе М. Ген р мыши расположен на й хромосоме, а человека на коротком плече й хромосомы р. Ген состоит из экзонов, которые разделены вариирующими по длине интронами рис.