Когерентная фазовая микроскопия биообъектов

• Автор: Кретушев, Александр Викторович
• Шифр специальности: 05.27.03, 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава 1. Развитие современной оптической микроскопии и проблемы создания метода динамической прижизненной микроскопии

1.1 Современная оптическая микроскопия внутриклеточных

процессов.

1.2 Интерферометрические методы

1.2.1 Многошаговый метод.

1.2.2 Оптическая когерентная томография

1.2.3 Когерентная фазовая микроскопия

1.3 Выводы.

Глава 2. Метод Когерентной Фазовой Микроскопии

2.1 Особенности фазовых изображений
2.2 Описание экспериментальной установки.
2.3 Свойства фазовых изображений КФМ Эйрискан
2.4 Метод Динамической Фазовой Микроскопии.
2.5 Выводы.
Глава 3. Сверхразрешение в динамических фазовых изображениях.
3.1 Сингулярные точки динамических фазовых изображений
3.2 Результаты измерений.
3.3 Выводы.
Глава 4. Мембранный электрооптический эффект в митохондрии
4.1 Показатель преломления митохондрий.
4.2 Подготовка митохондрий к измерениям на КФМ Эйрискан
4.3 Влияние среды на фазовую высоту митохондрий
4.4 Электрооптический эффект в митохондриях
4.5 Выводы.
Глава 5. Идентификация функциональных состояний изолированных
митохондрий методом динамической фазовой микроскопии
5.1 Подготовка образцов
5.2 Анализ динамических процессов в митохондриях.
5.3 Результаты измерений.
5.3.1 Корреляция интенсивности флуктуаций и фазовой высоты.
5.3.2 Влияние среды инкубации на пространственновременную
корреляцию.
5.4 Обсуждение.
5.4.1 Влияние энергетического состояния митохондрий на флуктуации фазовой высоты
5.4.2 Происхождение пространственновременной корреляции фазовой высоты
5.4.3 Динамический электрооптический эффект
5.4.4 Количественная оценка скорости метаболизма.
5.4.5 Возможность идентификации функциональных состояний митохондрий.
5.5 Выводы
Заключение
Литература


С другой стороны, малые размеры митохондрий ограничивают возможность применения электродных [,] и зондовых методов, а использование методов светорассеяния на суспензиях дает только некоторые средние статистические характеристики процессов. Методическая (диагностическая) часть проблемы оказалась значительно сложнее. Связь между оптическими и биофизическими параметрами далеко не однозначна. Поэтому даже в случае надежно установленной корреляции флуктуаций фазовой высоты и мембранного потенциала, интерпретация результатов измерений в терминах функциональных состояний предполагает использование различных, далеко не очевидных, предпосылок, моделей и гипотез. Следовательно, для устранения неоднозначности в интерпретации необходим поиск адекватных алгоритмов и разработка оптической модели объекта. В диссертации в качестве объекта исследований была выбрана митохондрия печени крысы. Этот выбор был связан с большим опытом возглавляемого академиком Скулачевым В. П. коллектива в области биоэнергетики и с любезно предоставленными профессором Ягужин-ским Л. С. препаратами. Процессы биоэнергетики являются в центре внимания биофизиков в течение многих лет и митохондриям посвящена большая литература. Однако, причины флуктуаций мембранного потенциала не вполне ясны. Высказаны предположения, что они связаны со случайным характером работы Н+ помп АТФазы и дыхательной цепи [,,], а также с открытием трансмембранных ионных каналов [,] и больших пор [,,]. Но пока не получили адекватного объяснения большие амплитуды флуктуаций мембранного потенциала [,,,], а также механизмы, которые приводят к появлению контрастных спектральных компонент [] и к пространственной корреляции флуктуаций мембранного потенциала []. Не вполне ясно, могут ли эти характеристики быть использованы в качестве значимых параметров для идентификации функциональных состояний митохондрий. В диссертации показано, что благодаря применению метода Когерентной Фазовой Микроскопии и реализации на его основе метода Динамической Фазовой Микроскопии [-], в сочетании с возможностями современной вычислительной техники и пакетами обработки сигналов, удалось получить ответ на ряд вопросов фундаментальных проблем биоэнергетики. Конкретной целью диссертационной работы было дальнейшее развитие метода Когерентной Фазовой Микроскопии, как основы для новой методологии исследования внутриклеточных динамических процессов. Конкретным результатом должна была быть принципиально новая информация о пространственно-временной корреляции флуктуаций показателя преломления. В качестве объекта были выбраны митохондрии, по которым в литературе имелись достаточно полные сведения о морфологии и биофизических процессах. ГЛАВА 1. Прогресс в лазерной технике и когерентной оптике способствовал появлению новых методов оптической микроскопии. Эти методы дают специфическую для каждого типа микроскопов информацию об оптических параметрах объекта. Информацию о распределении интенсивности светового поля в ближней зоне с рекордным для оптической микроскопии пространственным разрешением (до 1 нм), позволяет получить микроскопия ближнего поля. Сканирующие конфокальные микроскопы дают информацию о трёхмерной структуре объекта. Визуализировать оптически прозрачные (фазовые) объекты можно при помощи интерференционной и фазоконтрастной микроскопии (метода дифференциально-интеференционного контраста, фазоконтрастного микроскопа Цернике, интерференционного микроскопа Номарского). Количественную информацию о рельефе поверхности и распределении показателя преломления получают с помощью профилометров, методов фазовой микроскопии и томографии. При анализе, полученных различными методами изображений, важнейшую роль играет характер первичной информации. В связи с этим, под оптическим изображением в широком смысле следует понимать функцию координат определенной, физически значимой, характеристики рассеянной объектом волны, например, амплитуды, фазы или состояния поляризации. Эти функции естественно определяют соответственно амплитудный, фазовый или поляризационный образы объекта.