Разработка методик и систем ввода наноколичеств образцов в масс-спектрометр для решения задач поиска и идентификации аддуктов фосфорорганических соединений с сывороточным альбумином

• Автор: Краснов, Илья Александрович
• Шифр специальности: 01.04.01, 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Содержание

Цели и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая значимость работы

Апробация работы

Публикации

Структура и объем работы

1. Обзор литературы

1.1. Массспектромстрия. Принципы работы массспектрометричсских приборов

1.1.1. Общие положения

1.1.2. Основные принципы работы врсмяпролетного массспектрометра

1.1.3. Методы ионизации.
1.2. Фосфорорганическис соединения ФОС
1.3. Сывороточный альбумин, аддукты альбумина с ФОС.
1.4. Идентификация белков методами установления первичной последовательности.
1.4.1. Биохимические методы.
1.4.2. Массспектрометрические методы.
1.5. Металлаффинная хроматография
2. Материалы и методы.
2.1. Методы выделения сывороточного альбумина крови.
2.1.1. Аффинная хроматография.
2.1.2. БОБ гельэлектрофорез в ПАА
2.2. Ферментативный гидролиз с использованием трипсина
2.2.1. Ферментативный гидролиз белков трипсином в растворе
2.2.2. Ферментативный гидролиз белков трипсином в геле .
2.3. Металлаффинная хроматог рафия.
2.4. Массспектромстрический анализ и обработка данных
2.4.1. Массспектрометрический анализ методом ЕТОЕ.
2.4.2. Массспектрометрический анализ методом МАЬШТОР
2.4.3. Проведение массспектрометрического анализа
2.4.4. Обработка данных массспектрометрического анализа
2.4.5. Анализ с помощью тандемной массспекгрометрии
2.5. Наноэлсктроспрсй наноЭС.
2.6. Изготовление ВЭЖХ насадочных колонок и сборка системы ввода наноколичеств пробы в МХ на их основе.
3. Результаты и обсуждение.
3.1. Исследование сывороточного альбумина человека, модифицированного УХ
3.2. Разработка методики обнаружения модифицированных ФОС аминокислот в
сывороточном альбумине крови крысы.
3.2.1. Исследование альбумина сыворотки крови крысы, после добавления параоксона i vi.
3.3. Исследование сыворотки крови крысы, после добавления параоксона i vi
3.4. Наноэлектроспрсй.
3.5. Разработка системы ввода наноколичеств пробы в режиме хроматографирования
3.6. Поиск аддуктов сывороточного альбумина крысы с параоксоно.м с использованием разработанного оборудования
4. Основные результаты.
5. Список литературы.
Список сокращений
Англоязычные сокращения
vi i, сывороточный альбумин быка.
СРО хлорпирифос оксон.
диизопропилфторфосфат.
I iii электрораспылительная ионизация.
, бомбардировка быстрыми атомами.
биотин токсифосфинилЬ1биотинамидопснтилдсканамид.
I iiii i, иминодиуксусная кислота.
I ixi iiii матричная лазерная десорбциоиная ионизация.
ГА iiii i, нитрилгриуксусиая кислота.
i ii метод пептидных карт.
Ргх параоксон
i , додецил сульфат натрия.
Русскоязычные сокращения АХЭ ацетилхолинэстераза.
БХЭ бутирилхолинэстераза.
ВС I внутренний стандарт.
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография.
ВЭЖХМС сочетание методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и массспсктромстрии.
ГХ газовая хроматография.
ГХМС ГХМ сочетание методов газовой хроматографии и массспсктромстрии.
ДНК дезокси рибонуклеиновая кислота.
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота.
ЖХ жидкостная хроматография.
ЖХМС установка для жидкостной хроматографии, совмещенная с массспектрометром.
ЛД средняя смертельная летальная доза токсического вещества, необходимая для того, чтобы погибла половина членов испытуемой популяции.
Моль.
МЛ массанализатор. мг миллиграмм, мкг микрограмм, мл миллилитр. мМ миллимоль.
МС массспектрометрия, массспектромстрический анализ.
МСМС 2х ступенчатый тандемный массспектрометричсский анализ, нг нанограмм, нм нанометр.
ОВ отравляющее вещество.
ПААГ полиакриламидный гель.
Г1Д предел детектирования.
ПТД пламенный термоэлектронный детектор.
ПФД пламенный фотометрический детектор.
СНСА 4xi i альфа4гидроксикоричная кислота. СНСА ациано4гидроксикоричная кислота.
ТСХ тонкослойная хроматография.
ТФУ три фтор уксусная кислота.
ТФЭ твердофазная экстракция.
УФ ультрафиолетовое излучение.
ФЛ флуоресцентная детекция.
ФОН фосфорсодержащее отравляющее вещество.
ФОС фосфорорганические соединения.
ФТГ фенилтиогидантоин.
ХИ метод химической ионизации.
ЦНС центральная нервная система.
ЭГД электрогидродинамический.
ЭРИАД экстракция растворенных ионов при атмосферном давлении.
ЭС Ионизация Элсктрораспылением.
ЭУ Метод ионизации Электронный Удар.
Актуальность


Данный комплекс позволяет успешно анализировать сложные смеси при условии, что в пробе содержится примерно 0 пкМ анализируемого вещества, при этом минимальная скорость потока элюента, обеспечивающая эффективное разделение соединений, составляет 0 мклмин. Для того чтобы получить качественное распыление такого потока, требуется нагрев спутного газа в источнике ионов до 0С. Все перечисленное значительно усложняет процедуру анализа и не позволяет проводить анализ образцов, содержащих единицы пикамоль соединений. Таким образом, наряду с разработкой новых методов но обнаружению и идентификации аддуктов альбумина с ФОС, возникает необходимость создания отечественного массспектрометрического оборудования, которое позволяло бы эффективно проводить анализ сложных биологических проб, отличалось простотой в использовании, было экономично в расходных материалах. Примерами таких систем могут быть сочетание источников ионов напоЭС с времяпролетным массспектрометром и комплекс наноЖХЭСМС. Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы разработать системы ввода наноколичеств жидких образцов в массспектр ометр и методику определения аддуктов фосфорорганических соединений с сывороточным альбумином на примере вещества типа УХ УХ и нараоксона. Разработать методику, позволяющую обнаруживать аддукты белков с ФОС в биопробах. Обнаружить и идентифицировать триптические пептиды сывороточного альбумина, содержащие модификации ФОС. Методом тандемной массспектрометрии определить точные сайты модификации белков фосфороргапическими соединениями. Научная новизна работы. Предложена и реализована новая система ввода наноколичеств анализируемых соединений в массспектрометр, совмещающая преимущества ВЭЖХ хроматографии и метода ионизации наноэлскгроспрей, в которой колонка является наноэмиттером. Показана возможность использования нового комплекса наноЭСМС для решения задач, связанных с выявлением аддуктов белков крови с фосфорорганическими соединениями. Впервые с помощью метода мсталлаффинной хроматографии проведено обогащение образцов пептидами, модифицированными фосфорорганическими соединениями. Предложена и впервые разработана универсальная методика выделения фосфорсодержащих пептидов из биологических образцов. Впервые обнаружены и идентифицированы аддукты сывороточного альбумина человека с ИЛОС и сывороточного альбумина крысы с параоксоном. Система ввода наноколичеств анализируемых соединений в массспектрометр может быть состыкована с массспектрометром и применена в протеомпых исследованиях. Разработанная методика поиска аддуктов сывороточных альбуминов с фосфорорганическими соединениями может быть использована при разработке новых методик поиска маркеров интоксикации ФОС. Источник ионов наноЭС, совмещенный с системой ввода на основе наноЖХ для массспектрометра МХ, колонкананоэмиттер. Результаты экспериментального сравнения разработанного источника ионов с имеющимся отечественным приборным комплексом Миллихром Л МХ. Методика обогащения образцов пептидами, содержащими модификации ФОС с помощью металлаффиниой хроматографии. Универсальная методика, позволяющая обнаруживать аддукты ФОС с белками в биологических образцах. Методика определения модификации ФОС, включающая детектирование ранее идентифицированных аддуктов с помощью разработанных систем. Результаты экспериментального исследования сывороточных альбуминов и сывороток крови крысы и человека, обработанных соединениями, входящими в состав группы ФОС. Идентификация аддуктов сывороточного альбумина человека с VX и сывороточного альбумина крысы с параоксоном. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на научных семинарах ИАП РАН, на 9 симпозиуме, посвященном защите от химического и биологического оружия Гетеборг, Швеция, , 5 российском симпозиуме Белки и пептиды Казань, Россия, , 5 съезде общества биотехнологов России им. К.А. Овчинникова Москва, Россия, , конференции Американского массспектрометрического общества Денвер, США, , на конференциях Фундаментальная наука и клиническая медицина СанктПетербург, Россия, , МЕТРОМЕД СанктПетербург, Россия, , Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях СанктПетербург, Россия, .