Экспресс-методы серологической диагностики инфекционных заболеваний

• Автор: Воробьева, Зоя Глебовна
• Шифр специальности: 16.00.03, 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 308 с. : ил

1 Литературный обзор

1.1 Агглютинационные латексные методы.

1.2 Антигенные латексные диагностикумы

1.3 Антительные латексные диагностикумы.

1.4 Реакция агглютинации латекса при диагностике вирусных заболеваний

1.5 Значение иммунологических тестов при диагностике туберкулеза

2 Собственные исследования

2.1 Материалы, методы и объемы исследований.

2.2 Результаты исследований.

2.2.1 Разработка латексного туберкулезного антигенного диагностикума для выявления противотуберкулезных антител ЛТА.

2.2.1.1 Выбор латексного носителя.

2.2.2 Выделение белковой фракции из микобактерий туберкулеза и изготовление диагностикума.
2.2.2.1 Получение контрольного латексного препарата КЛ
2.2.2.2 Изучение способов стабилизации ЛТА
2.2.2.3 Изучение активности ЛТА в зависимости от сроков хранения
2.2.2.4 Определение биологической активности и специфичности ЛТА
2.2.3 Исследование эффективности РАЛ с сыворотками крови
крупного рогатого скота с использованием ЛТА.
2.2.4 Разработка латексного туберкулезного антителыюго диагностикума для выявления комплексных антигенов микобактерий
туберкулеза ЛТАТ.
2.2.4.1 Изготовление диагностикума и его стандартизация
2.2.5 Исследование эффективности выявления антигенов микобактерий туберкулеза с помощью ЛТАТ в биологическом материале6
2.2.6 Разработка способа диагностики туберкулеза крупного рогатого скота
с помощью внутрикожных проб на интактных морских свинках
2.2.7 Разработка латексного антительного диагностикума для обнаружения антигенов морбилливируса ЛЧД.
2.2.7.1 Изготовление диагностикума ЛЧД.
2.2.7.2 Стандартизация диагностикума.
2.2.8 Клинические испытания ЛЧД
2.2.9 Разработка латексных диагностикумов, определяющих концентрацию иммуноглобулинов класса 0ЛДап1л 1С, АЛДапЦ А,
МЛДапД М.
2.2.9.1 Изготовление ЛДапй ЛДапй А, ЛДапй
2.2. Использование ЛДапб 1, ЛДапй и ЛДапй 1М в клинической
практике.
3 Заключение
4 ВЫВОДЫ .
5 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
6 Список используемой литературы
7 ПРИЛОЖЕНИЕ1
Список сокращений, используемых в работе
БСА бычий сывороточный альбумин ИФ иммунофлюоресценция ИФА иммуноферментный анализ ИХ иммунная хроматография
ЛТА латексный туберкулезный антигенный диагностикум
ЛТАТ латексный туберкулезный антительный диагностикум
ЛЧД противочумный диагностикум
МАТ моноклональные антитела
М.В. молекулярный вес
М.М. молекулярная масса
МСФ микросферы
МФА метод флуоресцирующих антител ГТТТР полимеразная цепная реакция ПЭГ полиэтиленгликоль РАЛ реакция агглютинации латекса РДД реакция двойной диффузии в геле
РДП реакция диффузной преципитации в геле
РИА радиоиммунологический анализ РИД реакция иммунодиффузии в геле
РНГА реакция непрямой гемагглютинации
РГТГА реакция прямой гемагглютинации РСК реакция связывания комплемента СМЖ спиномозговая жидкость I иммуноферментный анализ I иммуноглобулин

ВВЕДЕНИЕ


Так, например, латексный реагент, приготовленный . Некоторые авторы предлагают сухие латексные диагностикумы , 8, а также тесты с сухими диагностикумами, нанесенными на стрипы. При использовании микросферы регидратируются и в реакции используют или суспензию, или непосредственно стрипы 9. Впервые предложенные серии латексных диагностикумов представляли собой белые суспензии, агглютинаты которых легко читались на черном фоне. В процессе развития РАЛ появились латексные диагностикумы, окрашенные в различные цвета. Так для тестирования стафилококков были предложены красные микросферы по методу и черные 1. Фирмой также предложен черный латексный диагностикум для тестирования . Н7. Учет реакции осуществляли через 2 минуты по изменению окраски фона, вследствие удаления из реагента одного цвета агглютината. Ю.В. Лукин, И. С. Павлова и С. К. Александер предлагают использовать для приготовления иммунореагентов полиакролеиновый латекс, окрашенный пиронином в розовый цвет , 0, 2, 7. Ргои1х с соавт. Если одна частица имеет диаметр 1мкм, для образования одного видимого агглютината необходимо 5 микросфер. Таким образом, для видимой агглютинации частиц с антигенами или антителами требуется 5 микросфер х 0 агглютинатов х связей микросфер. Если молекулярный вес МВ 0,0 соответствует МВ , тогда необходимое количество вступающего в реакцию вещества должно составлять Юпг. Если объем исследуемой пробы Юмкл, то чувствительность будет кмол. Если микросферы имеют диаметр Юмкм, то чувствительность теста будет только х ЮфМ. Зависимость чувствительности реакции агглютинации латекса от размеров частиц приводится в табл. Таблица 1. Молекулы Моли Если М. Данная теория имеет определенные ограничения 1 агглютинаты крупных МСФ могут испытывать на себе гидродинамическое давление и частично разрушаться 2 агглютинаты из крупных МСФ формируются относительно долго. Предполагается, что чувствительность РАЛ составляет приблизительно иг. Агглютинацию латексных частиц в упрощенном варианте обычно проводят на стекле, используя темный фон 7. При визуальной оценке результатов РАЛ этот тест представляет собой качественную реакцию. В количественном варианте РАЛ осуществляется с применением приборов и инструментов, способных регистрировать светорассеяние в зависимости от размеров агглютинатов. Свет с 0 0 нм лучше рассеивают МСФ, имеющие диаметр 0 0 нм. Вне этой области МСФ работают хуже. В практике можно начинать работать с МСФ 0,1 нм, которые мало рассеивают свет. При агглютинации эти МСФ быстро образовывают комочки размеры, которых позволяют лучше рассеивать свет и, тем самым, становится возможным анализировать исследуемую пробу в количественном варианте. Также можно начинать работать с МСФ, которые хорошо рассеивают свет размеры частиц 0. В практической деятельности большинство авторов используют все же принцип мелких, плохо рассеивающих свет МСФ, которые, склеиваясь, образуют хорошо рассеивающий свет агглютинаты. Эффективность этого метода для определения среактивного белка показана при сравнении с референсметодом. РАЛ при определении плацентарного лактогена в ти луночных планшетах, что позволило использовать эту реакцию для кинетического исследования и сократить время получения результатов до 2 сек. С с помощью турбидиметрии, автоматизировав таким образом способ определения уровня гломерулярной фильтрации. Е с использованием латексусиленного турбидиметрического анализа. Этот метод был апробирован в шести различных лабораториях. В качестве образцов использовали сыворотку, гепаринизированную плазму или плазму с цитратом натрия. Апробирование показало незначительное влияние содержания гемоглобина, жиров, билирубина, ревматоидного фактора и иммуноглобулинов типа X или к на проведение анализа. Минимальное количество иммуноглобулина Е, которое можно определить в плазме и сыворотке 2,0 МЕмл. Межлабораторный анализ проб сывороток показал хорошее соответствие между результатами в различных лабораториях. Для автоматизации проводимых исследований Т. М.Мс 7, i с соавт. МСФ проточных цитометров.