Создание рекомбинантного аденовируса птиц CELO, экспрессирующего ген фибера вируса ССЯ-76

• Автор: Капитонов, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Синдром снижения яйценоскости

кур ССЯ

1.1.1. Описание заболевания и история открытия ССЯ

1.1.2. Эпизоотологические особенности

1.1.3. Экспериментальная инфекция

1.1.3.1. Патогенез

1.1.3.2. Передача возбудителя

1.1.3.3. Вирусоносительство и вирусовыделение

1.1. 3.4. Симптомы 2

1.1.3.5. Патологоанатомические
изменения
1.1.4. Антигенная активность вируса ССЯ
1.1.5. Профилактика синдрома снижения яйценоскости
1.2. Структурнофункциональная организация аденовирусов
1.2.1. Гексон
1.2.2. Пентон
1.2.3. Другие структурные белки Ii, V,
VII, VIII, IX, XXII
1.3. Аденовирус птиц 0
1.3.1. Общая характеристика аденовируса
1.3.2. Структурнофункциональная
организация генома аденовируса
1.3.3. Эукариотические векторы на основе
генома аденовируса птиц
2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы 4
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы
2.1.2. Клеточные линии
2.1.3. Плазмидные векторы
2.1.4. Ферменты и другие реактивы
2.1.5. Животные 4
Ъ 2.2. Методы 4
2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.2.2. Выделение аналитических количеств
плазмидной ДНК
2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими
эндодезоксирибонуклеазам
2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном
геле
2.2.5. Препаративное разделение
фрагментов ДНК и элюция их из геля
2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК
2.2.7. Трансформация клеток . i
2.2.8. Определение нуклеотидной
последовательности ДНК
2.2.9. Полимеразная цепная реакция
2.2 Синтез дезоксиолигонуклеотидов
V 2.2 Трансфекция клеток линии для
получения рекомбинантных
аденовирусов
2.2. . Накопление вирусов
2.2 Очистка и концентрирование аденовирусов
2.2 Титрование вирусов
2.2 Выделение вирионной ДНК
2.2 Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом
2 .2 . . Гидрофобная хроматография
2.2 Реакция гемагглютинации
2.2 Реакция торможения гемагглютинации
2.2 Получение гипериммунной сыворотки
2.2 Электрофорез белков в ПААГДСН
2.2 Иммуноблоттинг I
2.2 Непрямой иммуноферментный анализ Ii I
3.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Конструирование рекомбинантного
аденовируса на основе генома
3.1.1. Получение гена фибера
4 3.1.2. Получение экспрессирующей кассеты,
содержащей ген фибера
3.1.3. Получение и очистка рекомбинантного вируса , несущего
экспрессирующую кассету, содержащую
ген фибера
3.1.4. Наращивание вируса СЕЬОФибер в препаративных количествах
3.2. Разработка иммуноферментной системы детекции фибера ССЯ
3.2.1. Получение очищенного белка фибера ССЯ методом ионообменной хроматографии
3.2.2. Анализ полученной фракции очищенного белка фибера ССЯ
3.2.3. Получение гипериммунной сыворотки и проверка ее специфичности
3.3. Экспрессия фибера ССЯ рекомбинантным
аденовирусом СЕЬОФибер
3.4. Исследование гуморального иммунного
ответа в организме лабораторных животных при инъекции им рекомбинантного вируса СЕЬОФибер 4 . ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ




4

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
Ад аденовирус,
БОЕ бляшкообразующая еденица ГАЕ гемагглютинирующая еденица Дн. дней
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФ иммунофлуоресценция
ИФА иммуноферментный анализ
кДа килодальтон
МДа мегадальтон
Нед. недели
ОП2 оптическое поглощение при длине волны 2 нм
п. о. пары азотистых оснований в молекуле ДНК
РГА реакция гемагглютинации
РДП реакция диффузной преципитации
РТГА реакция торможения гемагглютинации
ССЯ синдром снижения яйценоскости
Шт. штамм
вирус i I2 Рекомбинантный вирус , содержащий ген человеческого интерлейкина
Рекомбинантный вирус , содержащий ген экспрессирующейся щелочной фосфатазы
Фибер Рекомбинантный вирус , содержащий ген фибера вируса ССЯ
культура клеток гепатомы петуха леггорна
V промотор ранней области цитомегаловируса человека vi
свободные от патогенной микрофлоры
ВВЕДЕНИЕ


Общая характеристика аденовируса
1. Ъ 2. Трансформация клеток . V 2. Электрофорез белков в ПААГДСН
2. СЕЬОФибер 4 . БОЕ бляшкообразующая еденица ГАЕ гемагглютинирующая еденица Дн. Нед. Шт. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Серьезной проблемой современного промышленного птицеводства являются заболевания, протекающие без ярко выраженных клинических признаков. К такой группе относится заболевание, возбудителем которого является утиный аденовирус, поражающий курнесушек мясных и мясояичных пород в возрасте недели. Со времени подробного описания болезни синдрома снижения яйценоскости ССЯ , сделанного и др. Нидерландах, Северной Ирландии, Японии, Англии, Франции, Бельгии, Италии, США, Ираке и нашей стране. Для профилактики различных инфекционных заболеваний в ветеринарии используется вакцинация. Однако наиболее привлекательной для ученых всего мира является возможность получения живой генноинженерной вакцины. В настоящее время в качестве векторов для экспрессии генов в клетках млекопитающих i viv и i vi широко применяются аденовирусы Ад . Исследуется применение векторов на основе Ад человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин против для ветеринарии. В последние годы были осуществлены попытки создания векторов на основе Ад животных, в частности, на базе генома аденовируса птиц 1 серотипа . СЕЬО по отношению к различным типам клеток. Разработка иммуноферментной тестсистемы для определения антигена фибера вируса ССЯ. Определение уровня специфических антител к фиберу ССЯ в организме лабораторных животных при введении им рекомбинантного вируса СЕЬОФибер. Научная новизна и практическая значимость. В результате проведенной работы впервые получен рекомбинантный вирус СЕЬОФибер. Создан банк плазмид, содержащих ген фибера в различных прокариотических и эукариотических плазмидных векторах. Впервые получен препарат белка фибера ССЯ, очищенный методом двухстадийной гидрофобной хроматографии, определена его молекулярная масса и локализация в полипептидном спектре вируса ССЯ. Впервые разработана иммуноферментная тестсистема для определения антигена фибера вируса ССЯ. В ходе работы была показана эффективная экспрессия и функциональная активность гена фибера, встроенного в геном СЕЬО.