Разработка полимеразной цепной реакции с гнездовыми праймерами для выявления Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum

• Автор: Некрасова, Надежда Владимировна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 102 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Характеристика возбудителя некробактериоэа.

1.1.1 Морфология i

1.1.2 Культуральные и биохимические свойства

1.1.3 Патогенные свойства . .

1.2 Диагностика некробактериоэа

1.3 Схема разработки диагностической тестсистемы

1.3.1 Выделение хромосомной ДНК

1.3.2 Полимеразная цепная реакция. Подбор праймеров.

1.3.3 Параметры температурных циклов

1.4 Заключение по обзору литературы
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы и методы исследования
2.2 Конструирование полимеразной цепной реакции с гнездовыми праймерами для выявления . .
2.2.1 Выделение хромосомной ДНК микроорганизмов.
2.2.2 Выбор праймеров для постановки ПЦР.
2.2.3 Компоненты ПЦР
2.2.4 Оптимизация режимов постановки ПЦР.
2.2.5 Специфичность и чувствительность ПЦР для выявления
. .
2.2.6 Результаты исследований клинического материала
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4 ВЫВОДЫ







т



1
и
ЛИТЕРАТУРА


Шумилов указывал, что в оленьих стадах ежегодно в среднем регистрируется около тысяч оленей, заболевших некробактериозом 1,,5, из них отход составляет ,2. Борьба с некробактериозом до сих пор не увенчалась успехом. В связи с этим очень важно знать как этиологию, патогенез, так и другие аспекты дачкой инфекции, с тем, чтобы эффективнее проводить мероприятия, направленные на профилактику и ликвидацию этой болезни. Для профилактики и для ликвидации некробактериоэа первостепенное значение имеет своевременный и достоверный диагноз. Обычно эти методы попользуют комплексно. Основным приемом выявления Р. Методических указаниях по лабораторной диагностике некробактериозаи , является бактериологическое исследование микроскопия мазка, посев на питательные среды и биопроба на лабораторных животных. Эти методы диагностики имеет сбои минусы. Так. А, , В, выделяют и непатогенный биотип С. По морфологическим признакам все биотипы очень схожи . О.И. Соломаха, Л. В. Кириллов с соавт. Н.Е. Гришаев, Самоловов, . Поэтому выделить возбудителя заболевания достаточно сложно. При постановке биопробы выяснили, что лабораторные животные кролики, белые мыши,1 чувствительны не только к возбудителю некробактериоза, но и к сопутствующей микрофлоре. В целом на постановку диагноза затрачивается суток. В случае значительного обсеменения биологических образцов вульгарной микрофлорой зто время увеличивается на 0 дней. Е настоящее время наиболее чувствительными и специфичными признаны методы, основанные на выявлении фрагментов генома возбудителя в биологическом материале с помощью молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции Ю. И. Ерззве, . Необходимо отметить, что эти методы позволяют обнаружить концентрацию возбудителя в несколько раз меньшую, чем при традиционном бактериологическом исследовании. Это часто приобретает определяющее значение при постановке диагноза, так как в пораженном участке, помимо возбудителя заболевания . Поэтому выявление генома возбудителя в исследуемом материале с помощью генноинженерных методов ДНКДНК гибридизации и ДНКтехнологий полимеразной цепной реакции, позволяет сократить сроки диагностических исследований до дней и даже до нескольких часов. Специфичность, высокая чувствительность, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени являются признанными достоинствами данных методов А. Б. Масленников, Ю. И. Бравве, Л. А. Нагубкова, . Цель и задачи исследований. С учетом вышеизложенного, определена цель работы. Б. песгорЬогигп зиЬвр. Ьогигп от Р. Ьогит и другой микрофлоры, присутствующей в очагах поражения. Отработать методику выделения хромосомной ДНК РизоЬзсегш песгорЬогигп. Провести подбор праймеров, проанализировав последовательности генома возбудителя некробактериоза разных штаммов. Подобрать оптимальный режим для проведения ПЦР с эталонный штаммом РизоЬасьегигп песгорЬогигп аиЬзр. Ьогигп и изслятами. На основе ПНР с гнездовыми праймерами сконструировать лабораторный образец тестсистемы для выявления хромосомной ДНК патогенных биотипов РизоЬасегшп песгорЬогигп. Научная новизна. Отработана методика выделения хромосомной ДНК РиэоЬасЬег1иш песгорЬогигп. Впервые в Российской Федерации выбраны и синтезированы гнездовые праймеры, позволяющие в отработанном режиме проведения ШР выявлять геномную ДНК патогенных биотипов РизоЬзсЬегхигл песгорЬогшп. Разработан вариант ПЦРПДРФ для Р. Ьогшп аисзр. Ьогшп биотип АБ и проведено генетическое типирование депонированного штамма Чик ИЭБСиЦВ. Разработаны метод выделения геномной ДНК РизсЬзсЬегз. Ьогшп кз биологических образцов к полимеразная цепкая рекция с гнездовыми вложенными праймерами, позволяющая выявлять патогенные штаммы возбудителя к е кр об акт в р ио з а. Подана заявка на изобретение Способ выявление РизоЬасЬега. Ьогит в гнездовой ПЦРЧ получена приоритетная справка от декабря г. Апробация работы материалы диссертации доложены на международной научнопрактической конференции Покров, , на 5й международной научнопрактической конференции Абакан. Алматы, , на ученых советах ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН гг. Публикации по теме диссертации опубликовано 3 научные работы.