Разработка методов лабораторной диагностики цирковирусной инфекции свиней

• Автор: Тимина, Анна Михайловна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 130 с.

1.1. Классификация цирковирусов

1.2. Структурнофункциональная организация цирковирусов свиней

1.3. Патогенность цирковирусов свиней

1.3.1.Патогенность ЦВС1

1.3.2. Патогенность ЦВС2.

1.З.2.1. Синдром мультнсистсмного истощения отьмышен

1.3.2.1.1. Эпизоотология

1.3.2.1.2. Клинические признаки.

1.3.2.1.3. Патологоанатомические изменения

1.3.2.1.4. Патогенез СМИО.

1.3.2.1.5. Экспериментальная инфекция СМИО

1.3.2.2 Дерматит и синдром нефропатии поросят.
1.3.2.3 Инфекционные врожднные треморы.
1.3.2.4 Пролиферативная некротизирующая пневмония.
1.3.2.5 Комплекс респираторной патологии
1.3.2.6 Репродуктивные нарушения и перинатальный миокардит
1.4. Распространение цирковирусов свиней.
1.5. Диагностика цирковирусной инфекции свиней.
1.5.1. Обнаружение вируса или вирусного антигена
1.5.2. Обнаружение антител к ЦВС1 и ЦВС2
1.5.3. Дифференциальный диагноз.
1.6. Меры борьбы с цирковируспой инфекцией свиней
1.7. Заключение по обзору литературы.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Патологический материал
2.1.2. Клеточные культуры.
2.1.3. Вирусы и бактерии, используемые для проверки специфичности
2.1.4. Сыворотки
2.1.5. Бактериальные штаммы.
2.1.6. Плазмиды.
2.1.7. Реактивы.
2.1.8. Ферменты.
2.1.9. Среды и растворы.
2.1 Пероксидазный конъюгат
2.1Л 1. Прочие материалы
2.1 Оборудование
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Выделение ДНК
2.2.2. Расчет и синтез праймеров
2.2.3. ПЦР
2.2.4. Очистка продуктов ПЦР
2.2.5. Нуклеотидное секвенирование
2.2.6. Анализ первичной структуры нуклеиновых кислот
2.2.7. Молекулярное клонирование продуктов ПЦР
2.2.8. Экспрессия рекомбинантных белков.
2.2.9. Очистка рекомбинантных белков
2.2 Непрямой вариант ИФА
2.2 Коммерческие наборы.
2.2 Статистическая обработка результатов
2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.3.1.1. Разработка мультиплексной ПЦР для выявления и типирования цирковирусов свиней.
2.3.1.2. Применение мПЦР в диагностических исследованиях
2.3.1.2.1. Исследование патологического материала от свиней.
2.3.1.2.1.1. Синдром мультисистем ного истощения отьмышей и респираторный комплекс
2.3.1.2.1.2. Другие формы инфекционной патологии свиней
2.3.1.2.2. Исследование на наличие ЦВС2 материала от диких кабанов.
2.3.1.2.3. Исследование на наличие ЦВС клеточных культур, применяющихся в ФГУ ВНИИЗЖ для производства вакцин
2.3.2. Секвенирование и филогенетический анализ российских изолятов ЦВС2.
2.3.3. Разработка непрямого варианта ИФА на основе рекомбинантного белка ЦВС2 для выявления антител в сыворотках крови
2.3.3.1. Получение рекомбинантного капсидного белка ЦВС2 в системе экспрессии Е. соН.
2.3.3.2. Определение антигенной активности и специфичности рекомбинантного белка.
2.3.3.3. Разработка непрямого варианта ИФА методом последовательных разведений сывороток крови
2.3.3.4. Разработка непрямого варианта ИФА по одному разведению сывороток крови.
2.3.3.4.1. Выбор оптимального рабочего разведения сывороток
2.3.3.4.2. Определение позитивно негативного порога реакции
2.3.3.4.3. Определение допустимых величин оптической плотности контрольных сывороток.
2.3.3.4.4. Оценка воспроизводимости результатов серологической реакции
2.3.3.5. Сравнение результатов тестирования сывороток, полученных в разработанной тестсистеме относительно коммерческого набора
2.3.3.6. Применение разработанного непрямого варианта ИФА для изучения распространения ЦВС2 в хозяйствах РФ.
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ.
ВВЕДЕНИЕ


Ветеринарне забесиечення свинарства сучасний стран шляхи розвитку Харьков, г. Ii i ivi i i ivi, , I, , , на заседаниях учного совета ФГУ ВНИИЗЖ в гг. Метод обнаружения и типирования цирковирусов свиней, основанный на мультиплексной ПЦР. Результаты изучения клинических проявлений цирковирусной инфекции свиней в хозяйствах РФ. Результаты филогенетического анализа российских изолятов ЦВС2. Рекомбинантный капсидный белок ЦВС2 и разработанная на его основе иммуноферментная тестсистема для выявления антител к вирусу. Результаты использования разработанной иммуноферментной тестсистемы в серологическом мониторинге цирковирусной инфекции. Структура и объм работы. Диссертация изложена на 0 страницах и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и приложения. Список используемой литературы включает 7 источников, из которых 2 иностранных. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками. Исследования по диссертационной работе выполнены в гг. ФГУ Федеральный центр охраны здоровья животных ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю кандидату биологических наук Алексею Владимировичу Щербакову и сотрудникам лаборатории диагностики особо опасных болезней животных за оказанную практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы и оформлении диссертации. Цирковирусы мелкие безоболочечные вирусы, геном которых представлен кольцевой одноцепочечной ковалентнозамкнутой молекулой ДНК. В настоящее время семейство Сгсоугбае включает два рода Сгсоушб и ОугоУшБ 2. Цирковирусы свиней, а также цирковирус гусей , вирус болезни клюва и перьев 0, цирковирус голубей , цирковирус канареек 5 и цирковирус уток принадлежат к роду Сгсоуплб. Род Оугоугиь представлен единственным видом вирусом анемии цыплят . Он выделен в отдельный род, поскольку организация его генома отличается от других цирковирусов. Цирковирус свиней был впервые обнаружен немецкими исследователями как нецитопатогснный контами нант перевиваемой культуры клеток почек поросят РК в году 9. В году от поросят с синдромом послеотъмного мультисистемного истощения был выделен цирковирус, который отличался от вирусаконтаминанта по антигенным и биологическим свойствам 6, 7, 4. В связи с этим вирусконтаминант культуры клеток РК был обозначен как цирковирус свиней типа 1 ЦВС1, а вновь обнаруженный цирковирус как тип 2 ЦВС2 . Вирионы ЦВС представляют собой икосаэдрические частицы диаметром ,0,7 нм с плавучей плотностью в СбС 1,1,гсм3 и коэффициентом седиментации 8. Капсид вирионов состоит из капсомеров. В вирионах ЦВС обнаружен только один белок с молекулярной массой кД. Липиды и углеводы в составе вирионов не обнаружены. Цирковирусы не обладают гемагглютинирующей активностью, устойчивы к воздействию кислой среды 3,0, хлороформу, растворителям липидов и высоким температурам и С. Вирионы остаются стабильными при
С в течение минут и при С минут. ЦВС очень устойчивы к различным детергентам и дезинфицирующим средствам , 8, 0, , 0, 0, 4,, . Рис. Электронная микрофотография очищенных ЦВС частиц, негативно окрашенных 1 раствором у ран ил ацетата отрезок шкалы соответствует 0 нм. Культура клеток РК . Геном цирковирусов представлен одноцепочечной кольцевой ковалентнозамкнутой молекулой ДНК, что и дало название семейству и роду i i. Геномы цирковирусов являются самыми небольшими среди вирусов животных. Так, у ЦВС1 и ЦВС2 геномная ДНК состоит соответственно из и нуклеотидов. Геном цирковирусов организован очень просто. Он включает всего лишь две основные открытые рамки считывания ОРС, противоположно ориентированные и разделнные коротким межгенным участком рисунок 2. ОРС1 расположена на вирионной ДНК и кодирует две формы репликазы и . ОРС2, кодирующая капсидный белок вируса , расположена на комплементарной цепи ДНК, которая синтезируется с вирионной ДНК после инфицирования клетки вирусом, причем в ее синтезе участвуют клеточные ферменты. В составе генома цирковирусов также обнаружены несколько гипотетических минорных ОРС.