Разработка и применение ДНК зонда для выявления геномной РНК вируса вирусной диареи крупного рогатого скота

• Автор: Афонюшкин, Василий Николаевич
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 118 с. : ил

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Краткая характеристика возбудителя.

1.2 Молекулярная биология пестивирусов.

1.3 Ущерб наносимый животноводству, патологии вызываемые вирусом.

1.3.1 Эпизоотология

1.3.2 Г1невмопато1енность

1.3.3 Патология репродукции

1.3.4 Иммунные и иммунопатологические изменения вызываемые вирусом

1.4 Диагностика

1.4.1 Основные методы диагностики.

1.4.2 Выделение вируса на культуре клеток.

1.4.3 Антигенная вариабельность вируса, проблемы
серологической диагностики
1.4.4 Методы генодиагностики
1.4.4.1 Реакции ОТПЦР.
1.3.4.2 Молекулярная гибридизация.
1.5 Заключение по обзору литературы.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы и методы исследования.
2.2 Разработка ОТЦР и ДНКзонда
2.2.1 Разработка ОТП1 Р для синтеза ДНКзонда.
2.2.2. Поиск, оптимального для использования в качестве ДНКзонда, фрагмента генома вируса вирусной диареи.
2.2.3 Испытание ОТПЦР и отладка режимов
2.3 Синтез и испытание ДНК зонда в лабораторных условиях
2.3.1 Синтез кДПК.
2.3.2 Наработка ДНК зонда и мечение биотином
2.3.3 Контроль технологии получения зонда.
2.3.4 Изучение чувствительности и специфичности ДНКзонда.
2.4 Изучение возможностей использования ДНКзонда в сочетании с иммунологическим и серологическим методами для решения проблем диагностики вирусной диареи
2.4.1 Вариабельность титров антител к вирусу вирусной диареи среди свиней и крупного рогатого скота Новосибирской области.
2.4.2 Изучение иммуноморфологических изменений селезенки у животных с различными титрами вируснейтрализующих антител.
2.4.3 Анализ проб селезенок с различными иммуноморфологическими характеристиками полученных от серопозитивных и серонегативных бычков методом молекулярной гибридизации
3. ОБСУЖДЕНИИ.
4. ВЫВОДЫ.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
6. ЛИТЕРАТУРА.
7. ПРИЛОЖЕНИЯ.
Определения обозначения и сокращения.
кчс классическая чума свиней
ВДБС вирусная диарея болезнь слизистых
VV vi vi i vi вирус вирусной диареи
Тш температура плавления нуклеиновой кислоты
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК рибонуклеиновая кислота
Ревертаза фермент обратной транскрипции
ПЦР полимеразная цепная реакция
ОТ обратная транскрипция
ПААТ полиакриламидный гель
Шпилька вид вторичной структуры РНК, характеризующийся образованием
2х цепочечного участка РНК в месте локализации обратного палиндрома
Петля на стебле разновидност ь шпильки, имеющей на конце одноцепочечную петлю.
ТЬОМАлолимераза фермент обладающий как ДНК синтетазной, так и ревер газной активностью
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Учитывая, что в патогенезе заболевания играют роль как цитопатогенные, так и нецитопатогенные штаммы вируса, выявление и тех и других, приобретает большое значение. В настоящее время, наиболее чувствительными и специфичными, для диагностики инфекционных заболеваний, признаны методы, основанные на выявлении в материале нуклеиновых кислот, позволяющие значительно сократить время на постановку диагноза В. Разрабатываемые новые методы диагностики блот РНКДНК гибридизация, РНКДНК гибридизация i i и др. РНК ВД КРС с помощью плазмидных ДНКзондов , ii Ii М, . Однако плазмидные и фаговые ДНК зонды обладают недостаточной специфичностью, в связи с наличием гетерогенной векторной последовательности , , . Учитывая этот факт, наиболее перспективными являются ПЦРзонды не содержащие векторной последовательности i . Цель работы Сконструировать биотинилированный ПЦРДНКзонд для выявления геномной РНК вируса вирусной диареи крупного рогатого скота и изучить возможности его использования в сочетании с серологическими и иммунологическими методами. Провести подбор праймеров, анализировав последовательности генома возбудителя вирусной диареи разных штаммов для создания ОТПЦР и на ее основе сконструировать ДНКзонд дтя выявления геномной РНК различных биотипов вируса. В лабораторных условиях определить его чувствительность и специфичность. Изучить эффективность использования ПЦРДНКзонда, для индикации вируса вирусной диареи и выявления иммунотолерантных животных, в сочетании с серологическими и иммуноморфологическими методами исследований. Разработаны и синтезированы праймеры, позволяющие в отработанном режиме проведения ОТПЦР, осуществить синтез и биотинилирование ДНК зонда. Отработаны основные параметры постановки, изучена специфичность и чувствительность Нозернблот гибридизации. Проанализирована возможность использования ДНКзонда в сочетании с серологическими и иммунологическими методами исследования, для выявления иммунотолерантного к вирусу вирусной диареи крупного рогатого скота. Теоретическая и практическая значимость работы. На основе высокотемпературной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции ОТПЦР разработана технология изготовления
биотинилированного ДНКзонда, позволяющего выявлять геномную РНК вируса вирусной диареи в биологических объектах. Разработан комплекс диагностических исследований, включающих серологический, иммуноморфологический и гибридизационный метода, позволяющий повысить эффективность выявления инфицированного вирусом ВДБС крупного рогатого скота за счет обнаружения иммунотолернатных животных. Определены перспективы использования молекулярных зондов в выявлении иммунотолерантных к вирусу ВДБС животных, которые предоставляют новые возможности изучения патогенеза инфекции. Внедрение. Методические рекомендации Выделение РНК вируса вирусной диареи и индикация с помощью Нозсрнблот гибридизации. Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН, прот. Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии прот. Результаты исследований используются в учебном процессе. Проблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии Алматы, , на 5й международной научнопрактической конференции Абакан, , на ученых советах ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН гг. Публикации По теме диссертации опубликовано 4 научные статьи. Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки ГТЦР ДНКзонда для выявления РНК вируса вирусной диареи болезни слизистых крупного рогатого. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 8 страницах, содержит таблиц, 5 фотографий. Состоит из введения, обзора литературы,
собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы, приложений. Список литературы включает в себя 7 источников, из них 7 иностранных. Теоретический анализ, обобщение результатов, экспериментальные исследования выполнены автором самостоятельно. Автор выражает благодарность за участие в выполнении некоторых фрагментов диссертации с. ГНУ ИЭВСиДВ С. А. Юрик, за предоставление референтных штаммов бактерий заведующему лабораторией болезней молодняка ГНУ ИЭВСиДВ д.