Разработка диагностических тест-систем для ускоренной индикации латекс-агглютинации

• Автор: Бровкина, Анна Николаевна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : ил.

Введение

I. Обзор литературы

1.1.Актуальность проблемы пищевых токсикоинфекций

1.2.Характеристика бактерий рода .

1.3. Основные методы индикации бактерий рода в объектах внешней среды, пищевых продуктах
и кормах

1.3.1. Бактериологический метод исследования

1.3.2. Иммунологические методы исследования.

1.4. Принципы реакции латексагглютинации .

И. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы.

2.2. Результаты исследований
2.3. Оценка полимерных суспензий для использования
в качестве инертных носителей иммуноглобулинов
2.4. Иммобилизация антител на поверхность полимерных носителей методом физической адсорбции
2.5. Модификация поверхности полимерных носителей
с использованием белка А золотистого стафилококка.
2.6. Получение диагностических препаратов с использованием методов ковалентного связывания антител с карбоксильными функциональными группами полимерных носителей
2.6.1. Метод активации карбоксильных функциональных
групп с помощью водорастворимых карбодиимидов
2.6.2. Активация карбоксильных функциональных групп с помощью активированных эфиров
2.7. Изучение возможности индикации бактерий рода в пищевых продуктах, объектах окружающей среды и кормах
III. Обсуждение результатов
IV. Выводы.
V. Практические предложения
VI. Список литературы
VII. Приложения
ВВЕДЕНИЕ Проблему кишечных токсикоинфекций можно отнести к одной из актуальных и далеко еще не решенных в ветеринарной и медицинской практике. В борьбе с токсикоинфекциями животных и человека важное значение имеет повышение эффективности ветеринарносанитарных мероприятий, направленных на их предупреждение, а также объективный санитарнобактериологический контроль качества продукции животного происхождения и кормов.
Одно из ведущих мест в структуре токсикоинфекций продолжает занимать сальмонеллез. Источником заражения людей и животных наиболее часто являются продукты и корма, контаминированные возбудителями болезни, в связи с чем большую актуальность представляет вопрос совершенствования методов их индикации, которые могли бы обеспечить более достоверную лабораторную экспертизу различных материалов и быть доступными для широкой практики.
К числу таких методов относится реакция латексагглютинации РЛА.
Диагностические препараты, созданные на основе полимерных носителей ПН, находят широкое применение в диагностике различных заболеваний с целью обнаружения малого количества антител или антигенов в различных субстратах. Благодаря своим физикохимическим свойствам, полимерные частицы являются удобными носителями при создании различных диагностических тестсистем в области иммуноанализа. К преимуществам РЛА можно отнести следующие моменты простота и быстрота выполнения, отсутствие необходимости в сложной аппаратуре, воспроизводимость и точность, возможность получения
больших партий стандартных и однородных полимерных суспензий ПС.
Принцип работы антительных антигенных латексных диагностикумов основан на иммунохимической реакции между антителами антигенами, связанными с полимерным носителем, который выполняет исключительно индикаторную функцию, и антигенами антителами с образованием комплекса антигенантитело. Появление таких комплексов в виде агглютинатов позволяет проводить учет реакции невооруженным глазом.
Основным этапом создания латексных диагностикумов является специфическая адсорбция антител антигенов на поверхность полимера. Эффективность адсорбции определяется влиянием различных факторов среды, свойствами иммунологического компонента и физикохимическими особенностями ПН.
В ряде стран осуществляется коммерческий выпуск латексных диагностикумов. Известны диагностические препараты, созданные на основе инертных полимерных носителей для индикации в 1 возбудителей синегнойной инфекции Анциферова Н.Г. с соавт., , стрептококкоза ., , кандидоза . ., , эшерихиоза , , стафилококковой инфекции . . ., и др. Относительно низкая стоимость анализа, простота и быстрота выполнения, точность результатов делают РЛА незаменимой в качестве экспрессметода индикации микроорганизмов. Однако, вариант диагностических тестсистем, созданных на основе полимерных носителей, сенсибилизированных антителами, практически не используется изза трудности иммобилизации иммуноглобулинов на поверхность носителей. Эффективность адсорбции антител на
поверхность ПН и, следовательно, реакционная способность диагностикумов, определяется как свойствами антител, так и физикохимическими характеристиками поверхности частиц. Анализ данных литературы показывает, что сведения о характеристиках полимерных носителей практически отсутствуют, а способы сенсибилизации полимерной поверхности антителами не детализированы и противоречивы. Для создания специфичных и высокочувствительных тестсистем необходим подбор оптимальных условий и параметров процесса их изготовления. Диагностические препараты, созданные на основе ПН, могут быть широко применены в РЛА для выявления соответствующих антигенов в различных субстратах. В связи с этим, проблема разработки латексных диагностикумов не теряет своей актуальности и имеет большое практическое значение.
Цель работы
Создание диагностических тестсистем на основе полимерных носителей для реакции латексагглютинации.
Основные задачи
1. Изыскать способы и критерии оценки различных типов полимерных суспензий ПС для использования в качестве твердофазных инертных носителей иммуноглобулинов.
2. Разработать способ и изыскать оптимальные условия и режимы иммобилизации специфических антител на поверхность полимерных носителей, обеспечивающие высокую диагностическую эффективность тестсистем.
3. Изучить чувствительность и специфичность полученных тестсистем в реакции латексагглютинации.
4. Испытать разработанные диагностические тестсистемы для ускоренной индикации бактерий рода в пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды.
Научная новизна
Отработаны условия ковалентного связывания антител с карбоксильными функциональными группами полимерных носителей с помощью метода активированных эфиров, позволяющие получать чувствительные и стабильные диагностические тестсистемы для индикации бактерий рода в разных объектах.
Определены оптимальные параметры процесса изготовления диагностических тестсистем среды, температура, экспозиция, концентрация используемых химических реагентов и иммуноглобулинов класса .
Определены критерии оценки полимерных суспензий с целью определения возможности их использования в качестве инертных носителей антител.
Изыскан оптимальный режим изготовления
высокочувствительных и стабильных сальмонеллезных диагностикумов для реакции латексагглютинации.
Практическая ценность работы
Разработан способ изготовления диагностических тестсистем на основе полимерных носителей для индикации бактерий рода в объектах внешней среды, пищевых продуктах и кормах с помощью реакции латексагглютинации.
На основании результатов проведенных исследований предложены Методические рекомендации по изготовлению диагностических тестсистем для реакции латексагглютинации.
Результаты работы также вошли в Методические
рекомендации по ускоренной индикации сальмонелл в объектах ветеринарного надзора с помощью реакции латексагглютинации I утвержденные отделением ветеринарной медицины РАСХН ноября г
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ


Значительной эпидемиологической опасности экзогенно контаминированного мяса способствует то, что сальмонеллы, попавшие на его поверхность даже в небольшом количестве, способны значительное время сохраняться при низкой температуре, а при благоприятном температурновлажностном режиме могут интенсивно размножаться и проникать внутрь. Расширение промышленного производства мяса и мясных продуктов и их реализации приводит к существенному нарастанию риска заражения большого числа людей . К числу опасных пищевых продуктов, с точки зрения возникновения пищевых сальмонеллезов, относят фарш, студни, зельцы, низкосортные колбасы, мясные и печеночные паштеты. При измельчении мяса в фарш нарушается гистологическая структура мышечной ткани, а вытекающий мясной сок способствует рассеиванию сальмонелл по всей массе фарша и их быстрому размножению , 4, 4. В литературе довольно часто встречаются сообщения о вспышках сальмонеллеза, причиной которых служили как свежие, так и сухие замороженные яйца, а также различные кондитерские изделия и блюда, в состав которых входили яичные продукты . Большая роль яиц и яичных продуктов в распространении сальмонеллезов обусловлена, в первую очередь, тем, что они очень часто оказываются инфицированными сальмонеллами самых разнообразных сероваров. Яйца могут быть заражены
сальмонеллами как эндогенным, так и экзогенным путем . Эндогенно они инфицируются в яичнике в процессе их формирования и в яйцеводе птицнесушек, больных или сальмонеллоносителей. Экзогенному заражению яиц сальмонеллами способствуют интенсивное загрязнение скорлупы яиц экскрементами птицсамонеллоносителей, хранение яиц при повышенной температуре и влажности воздуха, увлажнение яичной скорлупы в результате перепада температуры и другие факторы , . Таким образом, продукты промышленного птицеводства являются важным фактором передачи возбудителей сальмонеллеза . Фактором передачи возбудителей сальмонеллеза также могут быть молоко и молочные продукты. Контаминация молока может быть первичной и вторичной. Первичная контаминация молока наблюдается довольно редко, главным образом в тех случаях, когда оно получено от коров, страдающих сальмонеллезными маститами или генерализованной формой инфекции. Чаще молоко контаминируется вторично. Возбудители могут быть занесены во время дойки с вымени, загрязненного навозом, руками, через инвентарь и т. Вспышки сальмонеллеза, обусловленные контаминированными молоком и молочными продуктами, как правило, охватывают значительное количество пострадавших и сопровождаются весьма тяжелым клиническим течением, так как молоко является хорошей питательной средой для сальмонелл , . Факторами распространения сальмонелл могут быть разнообразные полуфабрикаты, готовые блюда, кондитерские изделия или сухие полуфабрикаты для их изготовления. Вспышки
сальмонеллеза нередко могут быть связаны с различными кремовыми десертами, кексами, пирожными, майонезом и соусами, с различными готовыми блюдами, которые чаще способствуют распространению сальмонеллезов в результате нарушения технологии их приготовления, несоблюдения режима технической обработки, условий хранения и сроков реализации ,. Установлено, что различные растительные продукты могут быть контаминированны сальмонеллами и служить причиной заболеваний . Возможна передача возбудителей инфекции также с рыбой и рыбными продуктами . По мнению Покровского В. И. , вода, как фактор передачи инфекции при сальмонеллезе, имеет преимущественно опосредованное значение, являясь как бы передаточным звеном от источника к другим, более активным факторам его передачи. Реальную опасность инфицированная вода представляет при использовании ее на пищевых предприятиях и учреждениях общественного питания для обработки продуктов, мытья оборудования. Высока степень инфицированности сальмонеллами воды открытых водоемов. Основным путем передачи возбудителей инфекции для сельскохозяйственных животных служат корма. Отмечаются случаи высокой инфицированности сальмонеллами кормов, изготовленных из различных субпродуктов животного происхождения костная, мясная, мясокостная мука, кровяная мука, рыбная мука, различные кормовые концентраты и мука растительного происхождения. Готовые корма могут контаминироваться после их изготовления в процессе хранения, затаривания, погрузки, транспортировки и т.