Выявление и типирование возбудителей сальмонеллеза молекулярно-генетическими методами

• Автор: Яцышина, Светлана Борисовна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.стр.

ВВЕДЕНИЕ стр.

Актуальность проблемыстр.

Цель и задачи исследования стр.

Научная новизна работы стр.

Практическое значение работы стр.

Апробация диссертации i.

Структура и объем диссертации стр.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ стр.

Основные характеристики возбудителя и заболевания стр.

Систематика стр.
Патогенез стр.
Факторы патогенности сальмонелл стр.
Методы диагностики сальмонеллеза стр.
Традиционные методы типирования сальмонелл стр.
Основы генетического типирования бактерий стр.
Методы генетического типирования сальмонелл стр.
Факторы антибиотикорезистентности сальмонелл.стр.
Вакцины из аттенуированных штаммол сальмонеллстр.
Заключение. стр.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.стр.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.стр.
1. Разработка тестсистемы для выявления сальмонелл методом ПЦР.стр.
1.1 Выделение ДНКстр.
1.2 Штаммы Микроорганизмов, использованные в работе стр.
1.3 Клинический материал, использованный в работе стр.
1.4 Определение предела аналитической чувствительности стр.
2. Молекулярногенетическое типированис штаммов сальмонелл.стр.
2.1 Штаммы микроорганизмов, использованные в работестр.
2.2 Выделение ДНКстр.
2.3 Анализ .стр.
2.4 Амплификация гена .стр.
2.5 Амплификация фрагментов гена ivстр.
2.6 Проведение филогенетического анализа стр.
3. Выявление мутаций резистентности к рифампицину и
стрептомицину стр.
3.1 Тестирование резистентности к антибиотикам.стр.
3.2 Штаммы сальмонелл, использованные в работе.стр.
3.3 Амплификация гена гроВ.стр.
3.4 Амплификация фрагментов гена .стр.
4. Детекция фрагментов ПЦР стр.
5. Определение концентрации ДНК стр.
6. Секвенированис ДНК.стр.
7. Клонирование ДНК в фаг X стр.
7.1 Очистка фрагментов ПЦР стр.
7.2 Рестрикция фрагмента ПЦР стр.
7.3 Электрофорез, элюция фрагмента из гелястр.
7.4 Реакция лигирования стр.
7.5 Упаковка фаговых частиц стр.
7.6 Приготовление клеток Е.соНстр.
7.7 Высев упакованных частиц фага стр.
7.8 Отбор клонов и элюция фаговых частицстр.
7.9 Наращивание рекомбинантных фаговых частиц стр.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ стр.
Глава 1. Разработка тестсистемы дли выявления сальмонелл.стр.
1.1 Выбор оптимальных параметров ПЦР стр.
1.2 Создание внутреннего контрольного образца ДНК ВКО стр.
1.3 Определение специфичности и чувствительности тестсистемы стр.
1.4 Определение предела аналитической чувствительности гсст
сисгемы.стр.
Глава 2. Молекулярногенетическое типированис штаммов сальмонеллстр.
2.1 Генетическое типирование методом секвенирования ДНК.стр.
2.2 Генетическое типирование методом КАРОЯГЕРстр.
2.3 Выявление индивидуальных мутаций в ДНК вакцинных штаммов сальмонеллстр.
ОБСУЖДЕНИЕстр.
ВЫВОДЫстр.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯстр.
ЛИТЕРАТУРА


В связи с этим важной задачей является контроль средств специфической профилактики, применяемых на территории России. Многие из живых вакцинных препаратов изготавливаются из штаммов, являющихся аттенуированными спонтанными мутантами, которые не имеют
генетической характеристики. Таким образом, проведение генетического исследования аттенуированных вакцинных штаммов с выявлением их генетических особенностей и создание паспортов вакцинных штаммов является актуальной задачей, решение которой позволит усовершенствовать и стандартизировать контроль над средствами специфической профилактики сальмонеллеза. Цель исследований разработка тестсистемы на основе ПЦР для диагностики сальмонеллеза и генотипирование вакцинных штаммов сальмонелл. Разработать диагностический набор на основе ПЦР для выявления ДНК возбудителей сальмонеллеза и определить его аналитические характеристики. Выявить генетические различия между штаммами бактерий рода , относящимися к разным сероварам. Выявить генетические различия между вакцинными и полевыми штаммами бактерий рода , относящимися к одному серовару. Провести молекулярногенетическое исследование аттенуированных вакцинных штаммов сальмонелл в сравнительном аспекте с вирулентными штаммами с целью получения их молекулярногенетической характеристики молекулярногенетического паспорта. Выбраны праймеры для амплификации специфичной последовательности генома сальмонелл, на основе которых разработана тестсистема, обладающая 0 специфичностью и имеет предел аналитической чувствительности гэмл образца или гэ в пробе ПЦР. Впервые установлена возможность типирования вакцинных штаммов сальмонелл молекулярногенетическими методами. Разработанный подход позволяет типировать вакцинные штаммы сальмонелл на уровне сероваров, а также определять их индивидуальные генетические особенности. Показано, что мутации в генах, кодирующих РНКполимеразу и рибосомальные белки, изменяющие их аминокислотную последовательность, являются причиной аттенуации вакцинных штаммов сальмонелл. Разработана и внедрена в ветеринарную практику тестсистема IКОМ для диагностики сальмонеллеза методом полимеразной цепной реакции. Сертификат соответствия за 1 от . Впервые в РФ проведено генетическое типирование штаммов на уровне сероваров, а также определены генетические особенности вакцинных штаммов . Впервые в РФ разработаны идентификационные генетические паспорта вакцинных штаммов сальмонелл . По теме диссертации опубликовано 5 научных статей. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов ВГНКИ, г. Москва, г. I Международном конгрессе Биотехнология состояние и перспективы развития. Москва, г. IV Всероссийской научнопрактической
конференции Генодиагностика инфекционных заболеваний г. Диссертация изложена на 2 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, две главы результатов собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и приложение. Диссертация иллюстрирована рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 2 источника, в т. Сальмонеллез относится к широко распространенным зоонозам. Возбудителями сальмонеллеза являются бактерии рода семейства i, которые могут быть выделены практически от всех видов животных, в том числе млекопитающих, включая человека, рептилий, речной рыбы, птиц и насекомых. X0,5 мк. Окрашиваются но Граму отрицательно, являются факультативными анаэробами. Сальмонеллы хорошо растут на обычных питательных средах. Температурные границы их роста варьируют от 6 С до С оптимальная температура С. Границы питательных сред могут колебаться от 4,5 до 9,0 оптимум 7,,4. Все штаммы, за редким исключением, подвижны благодаря наличию жгутиков. Сальмонеллы продолжительное время сохраняют жизнеспособность в окружающей среде. В воде открытых водоемов и питьевой воде до 0 дней в почве мес. С до дней в сливочном масле 8 дней в яйцах и сырах до мес. Медицинская микробиология Учебник Гл. В.И.