Морфологическая и гистохимическая характеристика изготовленных in vitro хондротрансплантатов лошадей

• Автор: Пономарев, Игорь Владимирович
• Шифр специальности: 16.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Ульяновск
• Количество страниц: 98 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Объективные предпосылки возникновения метода тканевой

инженерии.

1.2. Особенности морфологии суставного хряща

1.3. Методы восстановления повреждений суставного хряща.

1.3.1. Радикальные хирургические методы.

1.3.2. Методы тканевой инженерии

1.3.2.1. Клеточная терапия

1.3.2.2. Трхмерные системы поддержки хондрогенного фенотипа

1.4. Альтернативные методы создания трхмерных хондротрансплантатов

1.5. Механическая стимуляция при создании тканеинженерных хондротрансплантатов

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Изолирование и культивирование лошадиных
хондроцитов в монослое
2.2. Культивирование хондроцитов в условиях
трхмерного состояния.
2.3. Морфологические, биохимические, гистологические
и иммуногистохимические исследования.
2.3.1. Биохимические исследования.
2.3.2. Гистологические и иммуногистохимические исследования.
2.4. Статистические методы исследований.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Анализ морфологических изменений тканеииженерных хрящевых конструктов
3.1.1. Морфологические изменения мембраны i
3.1.2. Морфологические изменения на матрице i
3.1.3. Морфологические изменения трхмерных хрящевых конструктов изготовленных без использования
матрицносителей.
3.1.3.1. Субклеточные изменения трхмерных конструкций.
3.1.3.2. Макроскопическая оценка хондротрансплантатов
3.2. Биохимический анализ тканеинженерпых
хрящевых конструктов.
3.2.1. Количественное определение кислых гликозаминогликанов.5
3.2.2. Количественное определение гидроксипролина
3.2.3. Количественное определение гидроксилизина.
3.3. Гистологический анализ тканеинженерпых
хрящевых конструктов.
3.3.1. Гистоморфологическая оценка хондротрансплантатов
на матрице i.
3.3.2. Гистоморфологическая оценка хондротрансплантатов
на матрице i.
3.3.3.Г истоморфологическая оценка хондротрансплантатов
изготовленных без применения матрицыносителя
3.4. Иммуногистохимические исследования тканеииженерных хрящевых конструктов.
3.4.1. Иммуногистохимический анализ коллагена II типа в хондротрансплантатах изготовленных без применения искусственных матриц носителей.
3.4.2.Иммуногистохимический анализ сульфатировапных
гликозаминогликанов в ТХКбМН.
4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.
ВВЕДЕНИЕ


Необходимость создания нового направления регенеративной медицины обусловлена ограниченной возможностью к самовосстановлению гиалинового хряща т viv. Основой метода тканевой инженерии является создание трхмерных хрящевых трансплантатов в условиях i vi и последующая их имплантация в область поражения поверхности сустава. В качестве клеточного материала для изготовления инженерных хондротраисплантатов используются аутологичные хондроциты, полученные путм биопсии. Изолированные из хрящевой ткани биоптата клетки размножают затем в монослойной культуре до необходимой концентрации, после чего их переводят в трхмерную форму. Для поддержания
пространственной формы существования клеток суставного хряща i vi применяют, как правило, различные резорбируемые матрицыносители ii . Их изготавливают либо из синтетических полимеров молочной иили гликолевой кислот, либо из органических материалов типа коллагена. Несмотря на многочисленные позитивные свойства, матрицыносители являются чужеродными агентами в среде как самого трансплантата, так и всего сустава в целом. Резорбция материалов, из которых состоят матрицы, в условиях суставной жидкости происходит значительно дольше год и более чем, к примеру, в костной ткани, а то и вовсе ограничивается капсулированием инородного тела. Процесс элиминации компонентов матрицносителей сопровождается повышением местного иммунитета, в частности, значительным увеличением количества макрофагов. К тому же продукты распада влияют на изменение среды как в условиях i vi, так и i viv. Необходимо учитывать и тот факт, что все предлагаемые в качестве матрицносителей препараты являются коммерческими продуктами и соответственно повышают конечную стоимость лечения. Исходя из этого была разработана концепция создания трхмерных хрящевых трансплантатов лошади без применения матрицносителей v, i, . В основе метода лежит способность клеток гиалинового хряща активно синтезировать компоненты внеклеточного матрикса коллаген и протеогликаиы в ответ на механическую стимуляцию. С помощью данной методики удалось получить хондротрансплантаты размером до 2 см в диаметре и толщиной до 3 мм, которые по своей природе являются полностью аутологичными пациенту, гак как состоят из собственных клеток II продуктов их синтеза. К тому же в процессе культивирования клеток в качестве необходимой добавки к питательной среде используется аутологичная сыворотка крови. Имеется незначительное количество публикаций но использованию лошадей в качестве экспериментальных животных i . Исходя из этого, изготовление объмных диаметром более 1 см и толщиной мм тканеинженерных конструктов из хоидроцитов лошади и изучение процессов формирования хрящевой ткани в них является актуальной задачей. Имеется ограниченное количество публикаций по созданию хрящевых трансплантатов без применения матрицносителей i . Таким образом, учитывая важность изучения процессов восстановления повреждений суставного хряща, проведение сравнительного анализа качества хондротранегшантатов, изготовленных по различным методикам в условиях i vi, является актуальной задачей, решение которой имеет не только теоретический, но и практический интерес. Цель исследования. Дать сравнительную морфологическую, биохимическую и гистологическую характеристику хондротрансплантатов лошадей, изготовленных i vi на основе коммерческих матрицносителей, и альтернативных им трхмерных хрящевых конструктов, созданных по оригинальной методике. Научная новизна. Выявлено положительное влияние механической стимуляции на изменение биохимических и гистологических параметров в трхмерных культурах хоидроцитов лошади i vi, что может являться фактором, повышающим адаптацию хрящевого регенерата к условиям сустава i i. В сравнительном аспекте изучены хондротрапсплантаты лошадей, созданные на основе современных матрицносителей и тканеинженерных конструктов, изготовленных по оригинальной методике. Выявлено, что независимо от природы и структуры материала носителя синтез основных компонентов внеклеточного матрикса происходит на поверхности хондротрансплантата, тогда как глубжележащие участки демонстрируют отсутствие поддержки хондрогенеза в ткани v.