Конформационные различия нативной и рекомбинантных форм изофермента С пероксидазы хрена, выявляемые радиохимическими и кинетическими методами

• Автор: Чубарь, Татьяна Анатольевна
• Шифр специальности: 15.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ГЛАВА 1. ПЕРОКСИДАЗЫ СТРУКТУРА II МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА.

1.1. Классификация пероксид аз и реакционный цикл

1.2. Структура иероксидаз и механизм расщепления перекиси водорода

1.3 Механизмы окисления донорных субстратов.

1.4 Эффекторные свойства ионов металлов.

ГЛАВА 2. МЕТОД РАДИАЦИОННОЙ ИНАКТИВАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

ГЛАВА 3. МЕТОД ТРИ П1 ЕВОЙ ИЛАНИГРАФИИ ТЕРМИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ ТРИТИЯ.

3.1. Основы метода

3.2. Горячие атомы

3.3. Анализ меченых препаратов
ГЛАВА 4. КОЫФОРМАЦИОННЫЕ ПЕРЕХОДЫ В БЕЛКАХ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
5.1. Реагенты и коммерческие препараты ферментов
5.2. Препараты рекомбинантной лероксидазы хрена.
5.2.1. Конструкция плазмид и мутантов.
5.2.2. Получение препаратов рекомбинантной пероксидазы хрена
5.3. Методы, использованные в работе
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 6. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАТИВНОЙ НИХ И
РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА РПХ МЕТОДАМИ
РАДИАЦИОННОЙ ИНАКТИВАЦИИ И ТЕРМИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ ТРИТИЯ
6.1. Субстратная специфичность и стабильность.
6.2. Радиационная инактивация.
6.3 Метод термической активации трития
ГЛАВА 7. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ
ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА МЕТОДОМ РАДИАЦИОННОЙ ИНАКТИВАЦИИ.
7.1. Мутанты активного центра пероксидазы хрена.
7 2. Бестриптофановый мутант пероксидазы хрена
7.3. Введение дополнительного остатка триптофана мутант РЬе1Тгр
7.4. Мутации в области пропионатов гемина
7.5. Мутация в дистальном кальцийсвязывающем центре.
ГЛАВА 8. ВЛИЯНИЕ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ И МАГНИЯ НА
ПЕРОКСИДАЗЫ РАСТЕНИЙ.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Между тем тритиевая планиграфия позволяет определить индивидуальные нуклеотиды в их последовательности, и в дальнейшем можно получить информацию об их стерической доступности, то есть о пространственной структуре молекулы нуклеиновой кислоты и экранировке ее участков другими компонентами комплекса Го, что нуклеиновые кислоты выдерживают условия тритиевой бомбардировки, было показано в ряде экспериментов, в которых меченая молекула РНК сохраняла свою способность к специфическим взаимодействиям, например реконструкции малой 5 субчастицы рибосомы Е. Таким образом, современная тритиевая планшрафия это общий метод исследования биочастиц неизвестной стереоструктуры. В данной диссертации показаны возможности мегода для уточнения структурных деталей процессов инактивации, вызванных, в частном случае, радиационным облучением фермента с известной кристаллической структурой. Такое совокупное использование ионизирующего излучения является новым направлением, особенно учитывая, что метод радиационной инактивации является одним из наиболее чувствительных к изменению структуры биомолекул. Объектом исследования была выбрана пероксидаза хрена, доступная в нашей лаборатории как в нативной форме, так и в рекомбинантной
дегликозилированной форме Псроксидаза хрена традиционно применяется в качестве метки в иммуноферментном анализе ИФА. На основе метода ИФА разрабатываются и внедряются в медицинскую практику тестсистемы для определения различных веществ, таких как гормоны, онкомаркеры, аутоангитела, иммуноглобулины, лекарственные соединения и т. Иммуноферментные наборы используются для целей лабораторной диагностики инфекционных, аллергических и других видов заболеваний, для осуществления лекарственного мониторинга. Так, например, для оценки функционального состояния щитовидной железы в медицине широко применяются ИФАпаборы для количественного определения тиреотропного гормона, тироксина общего и свободного, трийодтиронина, тиреоглобулина и антител к нему Таким образом, в данной работе на примере хорошо изученного и широко используемого в медицине фермента продемонстрированы возможности применения радиохимических методов, и в частности метода термической активации трития и метода радиационной инактивации, для целей сравнительной характеристики нативных и рекомбинантных препаратов белков и определения идентичности или, наоборот, различий одного и того же препарата. ГЛАВА 1. Гемсодержащие пероксидазы КФ X, где X определяется природой биологического восстановителя подразделяются на 2 суперсемейства пероксидазы растений и животных. Ферменты катализируют окисление различных электрондонориых субстратов перекисью водорода. Каталитический цикл начинается быстрым взаимодействием фермента и перекиси водорода с образованием т. Соединения I. Соединение I содержит 2 окислительных эквивалента оксиферрилгем и свободный радикал. Е, Е1 и ЕН нативный фермент и его Соединения I и соответственно, 5 и Р субстрат и продукт его одноэлектронного окисления. Формы пероксидазы хорошо различимы благодаря спектрам в видимой области, что позволяет измерять константы скорости элементарных стадий реакции методом остановленной струи. Суперсемейство пероксидаз растений классифицируется на 3 класса на основе гомологии аминокислотных последовательностей и особенностей посттрансляционной модификации 1. Класс 1 включает микробиальные прокариотические пероксидазы, а именно бактериальные каталазыпероксидазы КФ . Спероксидазу, СсР КФ . КФ Класс II это пероксидазы грибов, включающие лигниппероксидазу, i, марганецпероксидазу, МпР, и секреторные пероксидазы растительного типа Класс 1 это т. Пероксидазы двух последних классов КФ . Железо 1 иротопорфирин IX и два дистальных аминокислотных остатка, i и необходимы для эффективного катализа. Перекись водорода связывает с атомом железа и затем делротонируется i, который выполняет функцию основания смешает электронную плотность связи кислородкислород в сторону одного из атомов и таким образом способствует гетеролитическому расщеплению перекиси водорода.