Генетический анализ биохимических особенностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов

• Автор: Одиноков, Георгий Николаевич
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 157 с. : ил.

1.1. Современные представления об организации генома возбудителя чумы

1.2. Схемы внутривидовой классификации iii СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы бактерий, использованные в работе, и условия их культивирования

2.2. Методы исследования денитрифицирующей активности, ферментации глицерина, арабинозы, рамнозы, мелибиозы, продукции изоцитралиазы у штаммов Г. i

2.3. Определение питательных потребностей штаммов . i

2.4. Выделение бактериальной ДНК

2.5. Проведение полимеразной цепной реакции

2.6. Электрофоретический учет результатов

2.7. Определение нуклеотидных последовательностей генов

2.8. Проведение филогенетического анализа

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ У. i ОСНОВНОГО И НЕОСНОВНЫХ ПОДВИДОВ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ЧУМЫ
3.1. Характеристика штаммов У i из различных природных Очагов чумы по биохимическим признакам, лежащим в основе деления на подвиды и биовары
3.2. Определение питательных потребностей штаммовЕ i кавказского подвида
ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БИОВАРОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ
4.1. Определение структурнофункциональной организации генов пар оперона и других генов кодирующих редукцию нитратов
4.2. Сравнительный анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей генов арабинозного оперона у штаммов . i ГЛАВА 5. ВЫЯВЛЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ В ГЕНАХ КОДИРУЮЩИХ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ДЕЛЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ НА ОСНОВНОЙ И НЕОСНОВНЫЕ ПОДВИДЫ
5.1. Выявление изменений в структуре генов, у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, кодирующих ферментацию мелибиозы
5.2 Определение мутаций в генах биосинтеза изоцитратлиазы у штаммов i
ГЛАВА 6. УСТАНОВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ АУКСОТРОФНОСТИ ШТАММОВ i КАВКАЗСКОГО ПОДВИДА
6.1. Сравнительный компьютерный анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей генов, участвующих в биосинтезе аргинина
6.2. Выявление мутаций в генах биосинтеза фенилаланина, тирозина и витамина В1 тиамина
6.3. Исследование структурнофункционального состояния генов биосинтеза аргинина, фенилаланина, тирозина и витамина В1 тиамина у штаммов кавказского подвида
ГЛАВА 7. ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВНОСТИ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ВНУТРИВИДОВОЙ КЛАССИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Штаммы неосновных подвидов содержат интактный ген 1сШ и не способны к конститутивному синтезу изоцитралиазы. Показано, что отсутствие ферментации мелибиозы у штаммов У реэШ основного подвида обусловлено внедрением инсерционной последовательности 5 в ген те1В, кодирующий фермент галактозидпермеазу. У штаммов неосновных подвидов вставка 5 в гене теВ отсутствует. Впервые выявлены генетические основы ауксотрофности штаммов кавказского подвида, которые связаны с внедрением инсерционных последовательностей в гены аА и аговставкой п. О, инсерцией тиминового нуклеотида в геи МНи делецией п. Полученная молекулярная. У. реяШ основного и неосновных подвидов по генам, кодирующим биохимические признаки, лежащие в основе деления на подвиды и биовары, создает основу для разработки генетической схемы внутривидовой классификации возбудителя чумы. По результатам работы оформлены заявки на изобретение Способ определения подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы методом секвенирования . Приоритет от . Приоритет от . Практическая значимость работы. По результатам работы оформлены и утверждены методические рекомендации Определение подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы на основе секвенирования генов и агаСу контролирующих ферментацию рамнозы и арабинозы утверждены директором РосНИПЧИ Микроб. Протокол 6 от июня и Определение подвидовой принадлежности штаммов ii i методом мультилокусмного сиквенс тииирования утверждены директором РосНИПЧИ Микроб. Протокол 1 от февраля . В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы три штамма i КМ 0 алтайского, КМ 6 гиссарского и КМ улегейского подвидов в качестве рефереисштаммов этих подвидов. Полученные в ходе выполнения исследования данные по генетической организации штаммов . Генетика возбудителя чумы на курсах специализации по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ Микроб и курсах повышения квалификации по программе усовершенствования врачей по специальности бактериология при РосНИПЧИ Микроб. Штаммы возбудителя чумы основного подвида, циркулирующие в природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам, о чем свидетельствуют данные комплексного анализа микробиологических, биохимических и генетических свойств этих штаммов. В основе разного проявления, биохимических признаков, используемых при делении штаммов i на подвиды и биовары, лежат различные типы мутаций в генах, кодирующих эти признаки. ВяиА. Отсутствие ферментации арабинозы у штаммов алтайского и гиссарского подвидов обусловлено вставкой гуанинового нуклеотида в последовательность гена агаС. Разная биохимическая активность штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы по ряду дифференциальных признаков вызвана редукцией кодирующих их генов у основного подвида и их интактностыо у неосновных подвидов. Отсутствие ферментации мелибиозы штаммами основного подвида обусловлено внедрением в ген те1В галактозидпермеазы, а конститутивный синтез изоцитратлиазы у штаммов этого подвида вставкой двух нуклеотидов СС в последовательность регуляторного гена ШЯ. Штаммы неосновных подвидов содержат интактные гены те1В и сЛ. Причиной множественных питательных потребностей штаммов К реяНя кавказского подвида является инактивация у них ряда генов биосинтеза аминокислот и витаминов. Зависимость штаммов этого подвида по аргинину вызвана инсерцией 0 в ген агА, по фенилаланину вставкой п. Сг, по тирозину внедрением I0 в ген яга7, по тиамину ВО делецией п. ШС и инсерцией единичного нуклеотида в ВпН. На основе всего комплекса выявленных мутаций для штаммов кавказского и других подвидов, а также биоваров возбудителя чумы определены характерные генотипы, которые могут быть использованы при создании генетической схемы внутривидовой классификации К ревШ. Апробация работы. СНГ Современные технологии в реализации глобальной
стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств участников содружества независимых государств, Волгоград, VI Международной конференции Молекулярная диагностика и биобезопасность, М.