Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии

• Автор: Ботина, Светлана Геннадиевна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 287 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. МОЛЕКУЛЯРНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ, ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ И ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПРИРОДНЫХ И ПРОМЫШЛЕННЫХ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

1.1. Проблемы, возникающие при фенотипической идентификации молочнокислых бактерий

1.2. Особенности ГЦ состава ДНК молочнокислых бактерий. Применение метода ДНКДНКгибридизации для идентификации молочнокислых бактерий

1.3. Методы тигшрования ДНК

1.3.1. Методы, основанные на рестрикции ДНК

1.3.2. Применение метода геномной рестрикции для идентификации и паспортизации культур молочнокислых бактерий
1.3.3. Использование метода ДНКтипирования с помощью ПЦР для идентификации молочнокислых бактерий
1.4. Использование данных анализа последовательностей генов рРНК для идентификации молочнокислых бактерий и установления их филогенетического родства
1.5. Сравнительная характеристика некоторых молекулярногенетических методов типирования бактерий
Глава П. ЧАСТНАЯ БИОЛОГИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ, ИССЛЕДУЕМЫХ В РАБОТЕ
2.1. Частная биология бактерий вида i
2.1.1. История становления современной классификации грамположительных каталазоотрицатсльных кокков
2.1.2. Фенотипическая характеристика
2.1.3. Генотипические особенности
2.2. Частная биология молочнокислых лактобацилл
2.2.1. Морфологические свойства
2.2.2. Культуральные свойства
2.2.3. Биохимические свойства
2.2.4. Систематика
Глава III. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ПРОИЗВОДСТВЕННОЦЕННЫЕ СВОЙСТВА МОЛОЧНОКИСЛЫХ СТРЕПТОКОККОВ И МОЛОЧНОКИСЛЫХ ЛАКТОБАЦИЛЛ
3.1. Использование молочнокислых бактерий в пищевой промышленности в качестве заквасочных культур при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов. Основные
производственноценные свойства.
3.1.1. Кислотообразован и е 5. ГИегторИИш
3.1.2. Активность 5. кегторкИш по отношению к галактозе
3.2. Синтез экзополисахаридов штаммами молочнокислых бактерий
3.2.1. Структурно функциональная характеристика экзополисахаридов молочнокислых бактерий
3.2.2. Биосинтез ЭПС
3.2.3. Использование ЭПС штаммов молочнокислых бактерий в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1. Штаммы микроорганизмов
4.2. Питательные среды и условия культивирования бактерий
4.3. Микробиологические методы исследования
4.3.1. Микроскопирование
4.3.2. Определение ферментационной активности штаммов
4.3.3. Способность бактерий утилизировать сахара
4.3.4. Способность бактерий расщеплять эскулин
4.3.5. Определение спектра чувствительности к антибактериальным препаратам
4.3.6. Кислотообразующая активность штаммов
4.3.7. Способность штаммов синтезировать экзополисахариды
4.3.8. Способность бактерий ферментировать галактозу
4.4. Аналитические методы исследования
4.4.1. Количественное определение ЭПС
4.4.2. Определение содержания водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ
4.5. Генетические и молекулярнобиологические методы исследования
4.5.1. Выделение тотальной ДНК
4.5.2. Получение препаратов плазмидной ДНК
4.5.3. Рестрикция плазмидной и геномной ДНК
4.5.4. Электрофорез нативной и рестрицированной ДНК
4.5.5. Приготовление препаратов для проведения пульсгель электрофореза геномной ДНК
4.5.6. Пульсгель электрофорез геномной ДНК
4.5.7. Анализ рсстриктограмм геномной ДНК, полученных методом геномной рестрикции и пульс гель электрофореза РИСЕ
4.5.8. Компьютерный анализ подбора праймеров
4.5.9. Проведение полимеразной цепной реакции ПЦР
4.5 Выделение и очистка ДНК
4.5 Ссквенирование фрагментов генов
4.5 Филогенетический анализ последовательностей генов рРНК
4.5 Проведение
4.5 Анализ рестриктограмм геномной ДНК, полученных методом , построение филогенетических деревьев и определение генетических дистанций
4.5 Генотипирование генов вирулентности
4.5 Генотипирование генов устойчивости к антибиотикам
4.5 Генотипирование генов репликации и конъюгативного переноса
4.5 Геномный анализ
4.6. Статистическая обработка полученных данных
4.7. Программное обеспечение
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава V. ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
5.1. Сравнение данных генотипических и биохимических характеристик штаммов i, выделенных из кисломолочных продуктов
5.2. Филогенетический анализ типовых штаммов бактерий группы ivi рода на основании данных о строении генов рРНК
5.3. Идентификация подвидов i на основании данных о строении генов рРНК
5.4. Реклассификация таксономической принадлежности отечественных пробиотических штаммов лактобацилл
Глава VI. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ БАКТЕРИЙ РОДА , ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
6.1. Видообразование у бактерий сравнение генов рРНК у близкородственных видов энтерококков
6.2. Генотипирование молочнокислых энтерококков на возможное присутствие генов вирулентности, свойственных патогенным энтерококкам
Глава VII. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНАОБРАЗИЯ И АНАЛИЗ РАЗМЕРОВ ГЕНОМОВ ШТАММОВ I
Глава Vi. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПРИРОДНЫХ И ПРОМЫШЛЕННЫХ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
8.1. Изучение генетического разнообразия природных штаммов бактерий вида i
8.2. Генетическая паспортизация производственных пробиотических культур бактерий рода i
Глава IX. ХАРАКТЕРИСТИКА УСТОЙЧИВОСТИ К АНТИБИОТИКАМ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ РОДА I
Глава X. ИЗУЧЕНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
.1. Технологические свойства штаммов i, выделенных из кисломолочных продуктов
.2. Изучение технологических характеристик бактерий рода , выделенных из кисломолочных продуктов
.3. Идентификация и отбор антагонистически активных культур i . i
.4. Разработка заквасок с низкой постокислительной активностью
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
список использованной литературы


Е. i на основании способности последних к сбраживанию маннита и росту при содержании в среде до 7 . Однако многими исследователями справедливо отмечается трудность при идентификации бактерий родов и с использованием только фенотипических методов классификации 8, 6, 7. То же можно отнести и к другим представителям молочнокислых бактерий. Например, обнаружено несоответствие данных анализа последовательностей генов рРНК и классических фенотипических характеристик при идентификации мезофильных бактерий i . Так, при анализе микрофлоры кисломолочных продуктов домашнего изготовления обнаружены штаммы лактококков, способные к росту и ферментации молока при С. Вместе с тем при идентификации молочнокислых лактобацилл только с использованием стандартных микробиологических тестов также могут возникнуть определенные трудности более подробно вопросы о таксономии и генетике молочнокислых лактобацилл рассматриваются в следующей главе обзора. Так, идентификация близкородственных i ii . Также объективным фактом является то, что существует мало селективных сред, позволяющих дифференцировать различные виды и рода молочнокислых бактерий . РНК. ОСОБЕННОСТИ ГЦ СОСТАВА ДНК МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ДНКДНКГИБРИДИЗАЦИИ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Определение соотношения азотистых оснований в ДНК или молярного процента ГЦ является одним из классических генотипических методов и составляет неотъемлемую часть стандартного описания бактериального таксона. В бактериальном мире данные значения составляют от до 4. С высокой степенью статистической надежности показано, что среди штаммов одного вида вариабельность соотношения ГЦ пар составляет не более 3, и не более среди бактерий принадлежащих к одному роду . Молочнокислые бактерии характеризуются низким содержанием меньше мол ГЦ пар. Для бактерий рода это значение составляет . Для большинства энтерококков мол , хотя для . ГЦ состав лактококков колеблется от до и только у . Среди штаммов вида i это значение изменяется в пределах . Так при сравнительном анализе культур молочнокислых бактерий был определен ГЦ состав исследуемых штаммов ivi АТСС ,0, i 8 ,6, i . Из приведенных данных следует, что бакгерии родов и имеют близкий ГЦ состав ДНК и определение данного параметра не дает возможности точно дифференцировать бакгерии молочнокислых стрептококков и энтерококков. РНК для установления таксономического положения бактерий. И в настоящее время одним из наиболее распространенных методов сравнительного анализа тотального генома прокариот остается метод ДНКДНКгибридизации. Эксперименты по гибридизации ДНК используются для разграничения видов бактерий 8. Значения гомологии ДНК являются непрямым параметром, отражающим сходство нуклеотидных последовательностей двух геномов 8, 4, 1. Степень информативности результатов метода ДНК ДНК гибридизации быстро падает по мере уменьшения степени родства сравниваемых организмов. Другими словами, при использовании данного метода для определения уровня гибридизации между штаммами можно показать, что две культуры принадлежат к одному виду, но нельзя определить, насколько они таксономически далеки в том случае, если сравниваются представители разных видов. Поэтому использование этих результатов на внутриродовом уровне уже не является общепринятым, хотя во многих исследованиях применяется ориентировочный критерий принадлежности видов к одному роду при уровне сходства ДНК не менее . Таким образом, оценить сходство бактерий на более высоких таксономических уровнях с помощью метода ДНКДНКгибридизации невозможно, поскольку результаты гибридизации при уровне сходства ДНК менее попадают в область экспериментальной ошибки и считаются недостоверными . К недостаткам метода ДНКДНК гибридизации также можно отнести высокую зависимость от физикохимических параметров. Метод требует больших количеств ДНК 4. Часто данные гомологии ДНК, полученные в различных лабораториях, не согласуются или изза использования различных методических приемов или изза несоблюдения стандартных условий проведения экспериментов.