Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus

• Автор: Хасаева, Фатимат Машировна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 228 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Микробиологическая деградация гетероциклических соединении

производных пиридина.

1.1.1. Деградация пиридина

1.1.2. Деградация алкилпиридинов

1.1.3. Деградация гидроксипиридипов.

1.1.4. Деструкция пиридинкарбоновых кислот

1.1.4.1. Деградация пнколиновой пнридин2карбомовой кислоты.ЗУ

1.1.4 2. Деградация никотиновой пнриднн3карбоновой кислоты.

1.1.4.3. Деструкция изоникотиновой пирндшг4карбоиовой кислоты

1.1.4.4. Деградация 2,6дигшколиновой пирндин2,бдикарбоновой кислоты.
1.2. Анализ микроорганизмов методом МАЛДИ МС
1.2.1. Метод МАЛДИ МС.
1.2.2. МАЛДИ МС анализ микроорганизмов
1.2.2.1. Практическое применение микробного профилирования методом МАЛДИ.
1.2.2.2. Факторы, влияющие на качество и воспроизводимость спектров микроорганизмов, полученных методом МАЛДИ.
1.3. Современное состояние и иммобилизация клеток микроорганизмов для
целей биотехнологических производств и биодеградации ксенобиотиков
1.3.1. Общие характеристики процессов иммобилизации.
1.3.2. Связывание клеток микроорганизмов на поверхности нерастворимого носителя.
1.3.3. Включение клеток микроорганизмов в структуру полимерного носителя.
1.3.4. Иммобилизация клеток микроорганизмов с использованием мембранной технологии
1.3.5. Физиология иммобилизированных микроорганизмов
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Объекты исследования.
2.1.1. Соединения ряда пиридина субстраты и продукты деградации
2.1.2. Микроорганизмы деструкторы незамещенного пиридина, метил и димепшпиридинов
2.2. Идентификация выделенных микроорганизмовдеструкторов
2.2.1. Изучение культуральных и физиологобиохимических особенностей
2.2.2. Хранение штаммов бактерий АпЬгоЬасег Бр. КМ4, Я1юс1ососст vivii КМР и Шюс1ососсш егуИгороШ 2.МР.
2.2.3. Сохранение утилизирующей пиридины активности штамма бактерий АгИгоЬас1ег Бр. КМ4 после хранения.
2.2.4. Количественное определение потребления пиридина и его производных
2.2.5. Определение скорости утилизации пиридина
2.2.6. Анализ методом матричноактивироваипой лазерной десорбции ионизации МАЛДИ
2.2.7. Получение бесклегочпых экстрактов клеток бактерий АгЖгоЬасгег Бр. КМ4.
2.2.8. Выделение и идентификация индивидуальных продуктов деградации пиридинов
2.2.9. Выделение и идентификация продуктов деградации 2метилпиридина
2.2 Получение суспензионных клетокЛгШгоЬаЫег Бр. КМР
2.2 Иммобилизация клеток АгЬоЬасег зр. КМР в альгинате кальция
2.2 Определение потребления пиридина суспензионными и иммобилизованными клетками АпИгоЬаШг Бр. КМР
2.2 Сканирующая электронная микроскопия
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Выделение, идентификация и характеристики штаммов бактерий,
утилизирующих пиридин н его производные.
3.1.1. Выделение и характеристика штамма, утилизирующего незамещенный пиридин.
3.1.2. Выделение и характеристика штамма утилизирующего 2,4диметилпиридин
3.1.3. Секвенирование последовательности гена Я рРНК штаммовдеструкторов пиридина и 2,4диметилпиридина
3.1.4. Выделение и идентификация штамма, утилизирующего
метилпиридины и днмстплпиридин
3.1.5. Характеристика деградативной активности штамма Аг0ггоЬас1ег Бр. КМ4, утилизирующего метил и ди.метилпиридины.
3.2. Храпение штаммов бактерий, утилизирующих пиридин и его производные .
3.2.1. Лиофилизация клеток штамма АгЖгоЬаМсг яр. КМ
3.2.2. Тест на ускоренное хранение лиофилизированных клеток бактерий АгИгоЬаег Бр. КМ
3.2.3. Криокоисервация клеток штамма АпНгоЪааег Бр. КМ
3.3 Утилизирующая активность штаммовдеструкторов ниридинов после
длительного хранения.
3.3.1. Утилизация 2.6диметилпиридииа штаммом бактерийЛгИгоЬасег Бр. КМ2.МР,.
3.3.2. Утилизация 2метилпиридина штаммом бактерий АгЖгоЬасег Бр. КМ2МР
3.3.3. Утилизация 4мтшширидина штаммом бактерий АпЬгоЬасег Бр. КМ4МР
3.3.4. Утилизация незамещенного пиридина штаммом бактерий ЛпИгоЬасГег Бр. КМР.
3.3.5. Утилизация незамещенного пиридина штаммом бактерий Ююсососсиз vivii КМР
3.3.6. Утилизация 2,4димегилниридина штаммом бактерий КюАососсия егуНгороШ КМ2.3МР
3.3.7. Сравнительный анализ деструкции пиридина штаммами i . КМР и ivii КМР
3.4. Массспектрометрический анализ клеток бактерий
3.4.1. Сравнительный анализ биодеградирующих штаммов . КМР и . ivii КМР методом МАЛДИ
3.4.2. Влияние условий культивирования на МАЛДИпрофиль бактерий
3.5. Изучение пиридин и 2,6диметнлиридин окисляющих активностей
бесклсточнмх экстрактов пртробактеров.
3.6. Исследование путей деградации пиридина и его производных
3.6.1. Анализ и идентификация продуктов деградации 2,6диметилпиридина штаммом . 2.
3.6.2. Анализ и идентификация продуктов деградации 2мстилпиридина штаммом бактерий . КМ2МР
3.6.3. Анализ и идентификация продуктов деградации 4метилпиридина штаммом бактерий . КМ4МР
3.6.5. Превращение 2гидрокси и Згидроксипиридинов штаммом . КМР.
3.6.6. Анализ и идентификация продуктов деградации пиридина штаммом ivii КМР
3.6.7. Анализ и идентификация продуктов деградации 2,4днметилпиридина штаммом ii 2.4.
3.7. Деградация пиридина культурой, суспензионными и иммобилизованными
клетками . V
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Однако при частичном ингибировании их роста происходило образование пировиноградной кислоты VI , , . Рис. Пугь биодеградации пиколиновой кислоты iii i . Некоторые авторы в своих работах отметили, что выращенные па пиколиновой кислоте клетки . С, Н и 3 , i, а,б. При изучении биодеградации гшколиновой кислоты некоторыми почвенными бактериями, обнаружили ряд дикарбоновых кислот, содержащих 2, 5, 6 и 9 атомов углерода в цепи i . Авторы полагают, что эти кислоты являются предшественниками детиобиогина рис. Никотиновая кислота наиболее изученное производное пиридина. Исследователями была обнаружена способность многих штаммов Р. Дальнейшее окисление никотиновой кислоты штаммом . Вторым шагом является окислительное декарбоксилирование с образованием 2,5дигидроксипиридина. Далее происходит окислительное раскрытие пиридинового кольца 2,5дигидроксипиридина с образованием полуамида малеиновой кислоты и муравьиной кислоты. Гидролитическое деаминирование полуамида малеиновой кислоты приводит к образованию малеиновой кислоты и е изомера фумаровой кислоты. Появление интермедиатов такого строения позволяет предположить раскрытие кольца между 5 и б атомами углерода, хотя формилполуамид малеиновой кислоты обнаружен не был. При определнной концентрации арсенига происходит образование небольшого количества пировиноградной кислоты. Из клеток бактерий . I моль кислорода. Фермент не нуждался в НАДИ, и реакция не протекала в анаэробных условиях в присутствии акцепторов электрона. Выделенный из почвы штамм i . II и пировииоградной кислот IV , , . В условиях ограниченной аэрации в культуральной жидкости наблюдалось накопление 2,5дигидроксипиридина III рис. Таким образом, путь деградации никотиновой кислоты штаммом i . Рис. Пут разложения никотиновой кислоты бактериями i . Выделенный из почвы штамм бактерий i . В период роста клетки окисляли никотиновую кислоту I до 6гидроксиникотиновой II и 2,6дигидроксиникотиновой III кислот. Далее бактерии образовывали 2,3,6тригидроксипиридин IV путм окислительного декарбоксилировапия, после этого происходило раскрытие цикла с образованием полуамида малеиновой кислоты V рис. Рис. Путь разрушения никотиновой кислоты штаммом i . Ферменты штамма i . Предположительно, это связанно с тем, что либо строение и свойства этих ферментов очень схожи, либо эти два фермента образуют многофункциональный комплекс, способный катализировать обе реакции i, i, 6. Путь биодеградации никотиновой кислоты в анаэробных условиях бактериями ii отличается от пути деградации клетками и i . Первый шаг деградации никотиновой кислоты, окисление до 6гидроксиникотиновой кислоты, одинаков как для аэробных, так и для анаэробных условий, но в дальнейшем пути расходятсяТак, при анаэробном метаболизме этого соединенияатом кислорода гидроксильной группы 6гидроксиникотиновой кислоты происходит из воды, то есть реакция включает ковалентную гидратацию и последующую дегидрогенизацию , . При биодеградации никотиновой кислоты I штаммом ii . IV i, , , . Пировиноградная кислота служит источником электронов для дальнейших стадий метаболизма 6гидроксиникотиновой кислоты. Последующие эксперименты показали, что никотиновая кислота переводилась в эквимолярные количества пропановой кислоты VIII, уксусной КИСЛОТЫ, СОг и II3. V, дпметилмалеииовая кислота VI и пировиноградная кислота . Метилитакоиовая кислота V, скорее всего, является промежуточным соединенней между аметиленглутаровой кислотой IV и диметилмалеиновой кислотой VI. Фермент, катализирующий эту реакцию, выделен и охарактеризован как витамин В коэнзимзависимая аметилеиглутаратмутаза , i, . Путь биодеградации никотиновой кислоты штаммом ii . Опыты с меченой 7ы С никотиновой кислотой подтвердили данный путь . Из ила морского дна был выделен другой вид анаэробных бактерий, определнных как iiii, которые способны утилизировать никотиновую кислоту, используя е в качестве единственного источника углерода и энергии. В отличие от багетерий ii . С и II3, но не образовывал в качестве интермедиатов ни пропановую, ни уксусную кислоты I, i, .