Атомно-силовая микроскопия аффинных взаимодействий в микробиологии

• Автор: Краевский, Сергей Владимирович
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Оболенск
• Количество страниц: 107 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список Сокращений

Список иллюстраций

Список таблиц

Введение

Обзор литературы

Глава 1 Основные принципы сканирующей зондовой

микроскопии

1.2 Атомносиловая микроскопия

1.3 Артефакты зондовой микроскопии и способы их учта

1.4 Применение АСМ для исследования биологических

объектов
1.5 Белки и нуклеиновобелковые комплексы
1.6 АСМ и бактериальные клетки
1.6.1 Нанесение бактериальных клеток на подложку для
1.6.2 АСМ бактерий
1.7 АСМ и вирусные частицы
1.7.1 Нанесение вирусных частиц на подложку для АСМ
1.7.2 АСМ вирусов
Экспериментальная часть
Глава 2 Изучение специфического взаимодействия
бактериофагов и бактерий с помощью атомносиловой микроскопии
2.2 Материалы и методы
2.2.1 Приготовление бактериальных клеток и бактериофагов
2.2.2 Приготовление образцов для АСМ и ПЭМ
исследований
2.2.3 АСМ и ПЭМ
2.3 Результаты и Обсуждение
2.3.1 Результаты сканирования фагов
2.3.2 Исследование процесса инфицирования
бактериофагом бактерии с помощью АСМ
3.4 Контрольные эксперименты
Выводы
Глава 3 Изучение различных модификаторов поверхности призванных увеличить адсорбционные свойства подложек по отношению к бактериальным клеткам для дальнейших АСМ исследований
3.2 Материалы и методы
3.2.1 Модифицирование поверхности подложки с помощью
ЦТАБа п лектина
3.2.2 Модифицирование поверхности подложки с помощью
сывороточного альбумина БСА и глютарового альдегида
3.2.3 Модифицирование поверхности подложки с помощью
БСА, крахмала и агарозы
3.2.4 Нанесение бактериальных клеток на модифицированную поверхность
3.2.5 АСМ эксперименты
3.3 Результаты и обсуждение
3.3.1 Лектины
3.3.2 Модификаторы подложек на основе бычьего
сывороточного альбумина БСА и глютарового альдегида
3.3.3 Модификаторы подложек на основе крахмала и
агарозы
Выводы
Глава 4 Разработка аффинных поверхностей на основе
антител для распознавания нанофрагментов бактерий в растворах с помощью атомноснловой микроскопии
4.1.1 Антитела
4.1.2 Методы нанесения антител на поверхность
4.2 Материалы и методы
4.2.1 Получение бактериальных фрагментов
4.2.2 Приготовление биофункциональной поверхности
4.2.3 Выдержка биофункциональной поверхности в растворе аналита
4.2.4 АСМ эксперименты
4.3 Результаты и обсуждение
Выводы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Литература


изображении клеток . изображения . изображение клеток В. изображение выхода бактериофага V из клетки В. изображение контрольных экспериментов с клетками . АСМизображения . изображения . изображение модифицированной в тлеющем разряде слюды экспонированной в растворе белка и в растворе антител к . изображения фрагментов клеток i i i и . изображения фрагментов клеток i ii и . Атомносиловая микроскопия входит в относительно новую группу сканирующих зондовых микроскопий СЗМ методов исследований различных свойств объектов с крайне высоким пространственным, разрешением. СЗМ отсчитывает свою историю с г. СТМ ii , . Его создатели швейцарские ученые Хайнрих Рорер и Герхард Бинниг были отмечены Нобелевской премией по физике в году. В том же году был создан атомносиловой микроскоп ii , , использующий в своей основе детектирование обменного взаимодействия атомов, что значительно расширило применение зондовой микроскопии в различных областях, особенно в биологии, так как на изучаемые образцы перестало. Ряд ключевых преимуществ по сравнению с традиционными методами электронной микроскопии обусловил резкий рост популярности методики в микробиологии. К этим преимуществам относятся относительная простота приготовления образцов например, не требуется контрастирования атомами тяжлых металлов, отсутствие необходимости создания вакуума во время сканирования, возможность проводить исследование объектов в жидкости, в частности, изучать биологические объекты i viv и др. При этом не наноситься серьзный ущерб пространственному разрешению изображений позволяет строить трехмерные изображения поверхностей с разрешением вплоть до атомного. Вс это делает методику крайне актуальной для современных задач микробиологии и бионанотехнологии. Стоит отметить, что одним только получением изображений поверхности не ограничивается. i . Бионанотехнология современная биологическая наука, оперирующая наноразмерными объектами. Возможности получения нанообъектов и способность анализировать их качественно изменяют уже существующие подходы в исследованиях. Применение в бионатехнологии открывают новые перспективы для значительного увеличения чувствительности анализа и идентификации микроорганизмов. В данной работе представлены результаты исследования аффинного от англ ii сродство т. . Обнаружение аффинного взаимодействия решает одну из ключевых задач микробиологии идентификацию бактерий. В случае с исследованием взаимодействия бактериофагов с клеткой хозяина, позволяет также увидеть различные стадии процесса инфицирования во времени i viv от места первичного крепления бактериофага, до изменения структуры поверхности клетки и полного лизиса с выходом новых частиц бактериофагов. Данное исследование является крайне актуальным, т. Мирошников и др. , . Возможности были ярко продемонстрированы в работах с аффинными поверхностями на основе активных антител, позволив визуализировать высоко специфично сорбированные нанофрагменты бактерий. При этом использовалась возможность измерять толщину и шероховатость поверхностных биогшеиок, что позволило подобрать оптимальные концентрации исходных растворов и условия для создания монослоя из активных антител.