Молекулярная и биологическая характеристика лиганда рецептора NOD1, выделенного из Neisseria meningitidis

• Автор: Тухватулин, Амир Ильдарович
• Шифр специальности: 03.02.03, 14.03.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика подобных рецепторов.

1.1.1. Классификация, структура и функции подобных рецепторов

1.1.2. Сигнальные пути, ассоциированные с подобными рецепторами.

1.1.3. Участие подобных рецепторов в формировании реакций врожденного и приобретенного иммунитета.

1.2. Общая характеристика подобных рецепторов

1.2.1. Общая характеристика подобных рецепторов.

1.2.2. Сигналирование подобных рецепторов.

1.2.3. Лиганды и биологические эффекты рецепторов.

1.3. Участие и подобных рецепторов в формировании
полноценного иммунного ответа.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Бактериальные штаммы.
2.1.2. Клеточные линии
2.1.3. Плазмидные векторы.
2.1.4. Лиганды паттернраспознающих рецепторов ,2,4,5
2.1.5. Лабораторные животные
2.1.6. Ферменты и другие реактивы.
2.1.7. Лабораторное оборудование
2.2. Методы
2.2.1. Подготовка компетентных клеток ii i штамма 5.
2.2.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.2.3. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.
2.2.4. Условия культивирования ii iiii для препаративного выделения лиганда 1 рецептора
2.2.5. Определение интенсивности биолюминесценции в эукариотических клетках
2.2.6. Определение интенсивности биолюминесценции в
образцах гомогенатов органов трансгенных мышей линии
2.2.7. Измерение интенсивности биолюминисценции в организме трансгенных мышей в режиме реального времени
2.2.8. Измерение концентрации цитокинов в сыворотке периферической крови и гомогенате кишечника.
2.2.9. Постановка полимеразной цепной реакции
2.2 Измерение активности галактозидазы в культуре эукариотических клеток.
2.2 Измерение активности щелочной фосфатазы в культуре эукариотических клеток.
2.2 Определение количества живых клеток по окраске
метиленовым голубым
2.2 Определение количества живых клеток по реакции
с субстратом МТТ.
2.2 Получение лентивируса методом котрапсфекции
2.2 Выделение тотальной РНК из культуры клеток.
2.2 Реакция обратной транскрипции
2.2 Трансформация клеток . i.
2.2 Иммуноблотинг
2.2 Получение модифицированных линий клеток
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Анализ способности различных грамотрицательных бактерий активировать транскрипционный фактор в результате взаимодействия с 1 рецептором
3.2. Анализ способности менингококков различных серогрупп активировать транскрипционный фактор в результате взаимодействия с 1 рецептором.
3.3. Выделение и очистка молекулы, способной активировать транскрипционный фактор при взаимодействии с
1 рецептором
3.4. Идентификация первичной структуры фрагмента
менингококка серогрупны В, являющегося лигандом 1 рецептора
3.5. Сравнительный анализ активирующей способности лиганда 1 рецептора выделенного из . iiii с другими молекулами различной структуры в условиях i vi.
3.6. Сравнительный анализ активирующей способности лигандов 1 и рецепторов в условиях i vi
3.7. Определение влияния совместной стимуляции 1 и
рецепторов на уровень активации в условиях i vi
3.8. Изучение активирующей способности 1 рецептора вусловиях i viv.
3.9. Определение влияния совместной стимуляции 1 и
рецепторов на уровень активации в условиях i
3 Определение влияния эффекта усиления активации при последовательной стимуляции 1 и 5 рецепторов на уровень секреции цитокинов и хемокинов в сыворотке периферической крови и гомогенате тонкого и толстого кишечника
3 Определение влияния эффекта усиления активации при совместной стимуляции 1 и 5 на формирование протективного
иммунитета к летальным дозам i ii в условиях
i viv
ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


К настоящему моменту, идентифицировано пять семейств паттернраспознающих рецепторов мембраносвязанные подобные рецепторы i и лектиновые рецепторы Стипа С i , цитозольные Iподобные Ii и подобные i , а также секрстирующиеся во внеклеточную среду пентраксины и коллектины, относимые к суперсемейству лектиновых рецепторов Стипа, и фикколины 3,9. Представители данных семейств рецепторов экспрессируются широким спектром клеток, включая как иммунокомпетентные, так и неиммунокомпетентные клетки эпителиального и мезенхимального происхождения. При этом большинство способно распознавать целый спектр РАМР, имеющих различную химическую структуру и происхождение 4. Таким образом, используя ограниченный набор эмбриональнокодируемых клетки макроорганизма способны распознавать присутствие различных патогенов бактерий, грибов, вирусов, простейших, гельминтов. Связывание собственных лигандов с паттернраспознающими рецепторами приводит к запуску внутриклеточных сигнальных каскадов, приводящих, в конечном итоге, к активации ряда транскрипционных факторов АР1, , I 3,5,7 и др. Среди них является основным провоспалительным транскрипционным фактором, регулирующим экспрессию ряда молекул, которые могут принимать участие в развитии реакций как врожденного, так и приобретенного иммунитета секреция провоспалительных цитокинов и хемокинов, синтез антимикробных пептидов, активация фагоцитоза макрофагами, созревание дендритных клеток и др. Одними из , активация которых приводит к индукции являются представители наиболее изученного семейства мембраносвязанных подобных рецепторов. Тклеток, повышении экспрессии кости мул игорных молекул и необходимых для активации наивных СБ4Тклеток, пролиферации и созревания Вклеток во время инфекции, прямой активации В клеток памяти и последующей продукции антител, в том числе I и многих других 5. Ключевая роль подобных рецепторов в формировании полноценного антимикробного иммунитета была показана в различных экспериментах с использованием мышей с нокаутными генами данных рецепторов. Способность лигандов подобных рецепторов запускать различные реакции иммунной системы позволяет использовать данные молекулы в качестве средств немедленной защиты против патогенов, молекулярных адъювантов и др. По сравнению с подобными рецепторами способность рецепторов активировать изучена в значительно меньшей степени. Лигандами рецепторов являются различные молекулы, представляющие собой фрагменты пептидогликана грамположитсльных и грамотрицательных бактерий. Было показано, что минимальным фрагментом пептидогликана достаточным для активации 1рецептора, является дипептид i, присутствующий в составе клеточной стенки большинства грамотрицательных бактерий ii iiii, ii i, i xi, i ii и др. Однако вклад других аминокислот и моносахаридов, входящих в состав пептидогликана бактерий различных видов в активирующую способность лигандов 1рецептора на сегодняшний день мало изучен. Также практически отсутствуют данные, описывающие значение рецепторов в формировании защитных иммунных реакций и протективного иммунитета в условиях i viv 3. Еще меньше данных получено при изучении совместного функционирования нодобных и рецепторов в распознавании целого патогенного микроорганизма и определение вклада того или иного типа паттернраспознающего рецептора в формировании полноценного протективного иммунитета организма. Целью работы являлось изучение активирующей способности рецептора 1, а1 также его роли в индукции иммунных реакций, включая участие в формировании антибактериального иммунитета совместно с подобными рецепторами. В процессе выполнения работы предстояло решить следующие. Разработать технологию очистки лиганда 1 рецептора из наиболее эффективного бактериального штаммапродуцента. Идентифицировать первичную структуру лиганда 1 рецептора выделенного из бактериального штаммапродуцента. Провести сравнительный анализ активирующей способности лиганда 1 рецептора, выделенного из бактериального штаммапродуцента, с другими лигандами 1 рецептора с различной структурой в условиях i vi. Определить влияние совместной стимуляции 1 и подобных рецепторов на уровень активности, транскрипционного фактора в условиях i vi и i viv. Определить влияние совместной стимуляции 1 рецептора и подобного рецептора 5 на уровень секреции цитокинов в условиях i viv.