Серологический мониторинг вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа

• Автор: Сивков, Георгий Викторович
• Шифр специальности: 03.01.06, 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Щёлково
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота

1.1.1. Диагностика инфекционного ринотрахеита.

1.1.1.1. Традиционные методы диагностики инфекционного ринотрахеита

1.1.1.2. Иммунофермеитный метод для диагностики ИРТ

1.1.1.3. Диагностика ИРТ с помощью гибридизации ДИК и полимеразной цепной реакции.

1.1.2. Диагностика вирусной диареиболезни слизистых

1.1.2.1. Общие положения в диагностике инфекции.

1.1.2.2. Иммунофермеитный анализ в диагностике ВДБС.

1.1.3. Лабораторная диагностика РС инфекции

1.1.4. Лабораторная диагностика парагриппаЗ.
1.1.4.1. Ретроспективная диагностика ИГ
1.1.4.2. Сравнение методов серодиагностики парагриппа
1.1.5. Диагностика аденовирусной инфекции.
1.1.5.1. Серологическая идентификация.
1.1.5.2. Ретроспективная диагностика
Заключение.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Анализ эпизоотической ситуации в хозяйствах РФ.
3.2. Определение этиологической структуры респираторных вирусов в
возникновении патологий крупного рогатого скота.
3.3. Совершенствование тестсистемы ИФА для выявления антител к антигенам вирусов ИР Г, ПГ3, ВДБС, РС и АВ инфекций
3.3.1 Промышленное культивирование клеток ПТ
3.3.2. Очистка и концентрирование вирусов и получение антигенов
3.3.2.1. Вирус парагриппа3.
3.3.2.1.1. Репродукция вируса парагриппа3.
3.3.2.1.2. Очистка и концентрирование вируса ПГ
3.3.2.1.3.Получение антигена для иммуноферментного анализа ПГ3.
3.3.2.1.4. Изучение белков вируса ПГ3.
3.3.2.2. Получение аденовирусных антигенов для ИФЛ
3.3.2.3. РСвирус
3.3.2.3.1 .Репродукция РСвируса.
3.3.2.3.2.0чистка и концентрирование РСвируса.
3.3.2.4. Вирус ИРТ.
3.3.2.4.1 .Репродукция вируса ИРТ
3.3.2.4.2. Очистка и концентрирование вируса ИРТ.
3.3.2.5. Вирусная диареяболезнь слизистых.
3.3.2.5.1. Получение антигена для ИФА
3.3.3. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕСТСИСТЕМЫ ИФА.
3.3.3.1. Установление оптимального рабочего разведения сывороток.
3.3.3.2. Определение позитивнонегативного контроля значений
величины титра Т
3.3.3.3. Определение допустимых величин оптической плотности контрольных сывороток.
3.3.3.4. Оценка воспроизводимости результатов серологической реакции
3.3.3.5. Диагностическая чувствительность и специфичность метода.
3.3.4. Получение положительных контрольных сывороток к антигенам вирусов ИРТ, ПГ3,ВДБС, РС,
АВ и отрицательной референс сыворотки
3.3.4.1. Получение специфических к вирусам сывороток крови.
3.3.4.2. Получение отрицательной референссыворотки крови
3.3.5. Получение антиС коньюгата
3.4. Оценка эффективности иммуноферментной тестсистемы для
выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ3, ВДБС, РС и АВ в сравнении с методами аналогичной направленности
3.5. Исследование молозива коров на наличие антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ3, ВДБС, РС и АВ в
тест системе ИФА
3.6. Серологический мониторинг поголовья крупного рогатого скота
на наличие респираторных болезней.
3.7. Анализ результатов серологического мониторинга поголовья
крупного рогатого скота.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛ ЕДОВАНИЙ
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АВ аденовирус
АВИ аденовирусная инфекция
БП биологическая проба
ВДБС вирусная диарея болезнь слизистых
Д дальтон
кД килодальтон
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ЗФР забуференный физиологический раствор
ИРТ инфекционный ринотрахеит
ИФЛ иммуноферментный анализ
ИЭФ иммуноэлсктрофорез
МА моноклональные антитела
МЕ международные единицы
ММ молекулярная масса
МФАметод флюоресцирующих антител
о.е. оптические единицы
ОГЛ оптическая плотность
ОП0 оптическая плотность при 0 нм
ОФД ортофенилендиамин
КРС крупный рогатый скот
ПААТ полиакриламидный гель
II Г3 парагрипп
ПТ перевиваемая линия клеток почки теленка
ПЭГ полиэтиленгликоль
ЦР полимеразная цепная реакция
реакция нейтрализации
РС респираторносинцитиальный вирус
РДП реакция диффузионной преципитации
РНГА реакция непрямой гемагглютинации
РСК реакция связывания комплемента
РТГА реакция торможения гемагглютинации
ТФИФА твердофазный иммуноферментный анализ
ТЦЦ тканевая цитопатическая доза
ФБР фосфатный буферный раствор
ФИТЦ флуоресциина изотиоционат
1 иммуноглобулин
в иммуноглобулин класса в
ВгСМсефароза бромциансефароза
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Определение этиологической структуры респираторных вирусов в возникновении, патологий крупного рогатого скота. Результаты серологического мониторинга поголовья крупного рогатого скота на наличие вирусных респираторных болезней. Личный вклад. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы проводились совместно с сотрудниками отдела молекулярной биологии ГНУ ВНИТИБП Д. П. Кузнецовым, С. В. Кузнецовой, И. И. Кочиш, Т. Ю. Кочиш, С. Ю.Филипловым, патентоведом института С. И. Бехтеревым. Автор выражает признательность академику РАСХН А. Я. Самуйленко и всем исполнителям и участникам за помощь в выполнении диссертационной работы. Объем и структура диссертации. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками, 1 схемой. Список литературы включает 5 источников, в том числе 3 отечественных и 2 зарубежных. Они наносят серьезный экономический ущерб животноводству, связанный с потерей живой массы скота, снижением молочной продуктивности, нарушением воспроизводства и гибелью молодняка. Вспышки острых респираторных заболеваний крупного рогатого скота ОРЗ КРС на протяжении последних лет регистрируются во многих регионах России, и представляют постоянную эпизоотическую угрозу И. А. Бакулов, , Юров К. П., , Реджеиова Г. Р., , Сисягин П. Н., , Петрова О. Вирус ИРТ вызывает заболевание КРС различных возрастных групп, проявляющееся поражением верхних дыхательных путей у телят возможна пневмония, вагинитами, энцефалитами, конъюнктивитами и артритами. ИРТ остропрогекающая контагиозная болезнь КРС, наносящая значительный экономический ущерб, который складывается из снижения удоя в период болезни, увеличения сервиспериода и яловости коров, слабого развития молодняка и значительным процентом гибели и выбраковки телят. Вирус диареиболезни слизистых ВДБС вызывает пневмоэнтериты у телят, аборты у коров первой половине беременности, а заражение телят в более поздние сроки приводит к рождению телят с врожденными уродствами, слаборазвитых, толерантных, впоследствии превращающихся в постоянный источник инфекции в стаде. Вирус парагриппаЗ ПГ3 вызывает у КРС респираторное заболевание, но наиболее характерной является латентная форма инфекции. ПГ3 часто осложняет течение других болезней. Респираторносинцитиальная инфекция крупного рогатого скота контагиозная болезнь, клинически проявляющаяся повышением температуры, снижением аппетита, затрудненным дыханием, одышкой, истечениями из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем. Респираторносинцитиальная инфекция крупного рогатого скота не вызывает большого отхода животных, но тяжелое и длительное течение с осложнениями приводит к потере продуктивности, вынужденному убою. Однако в отличие от других вирусных респираторных инфекций, распространение и наносимый экономический ущерб этим заболеванием остаются изученными недостаточно, что связано, прежде всего, со сложностью выделения и культивирования РСвируса. Это в свою очередь затрудняет получение в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью вирусного сырья для диагностических препаратов и средств специфической профилактики. По данным МЭБ аденовирусную инфекцию АВ более лет регистрируют во многих странах мира. Англии, США, Венгрии, Болгарии, Голландии, Канаде, Австрии и др Первые сообщения о неблагополучии хозяйств в отношении АВ инфекции появились в конце годов Алиева Н. А., Гуненков В. В. и др. Но до сегодняшнего дня в нашей стране роль аденовирусов в респираторнокишечной патологии у КРС и вопросы циркуляции различных серотипов возбудителя изучены недостаточно. Аденовирусную инфекцию диагностируют преимущественно у молодняка КРС, она характеризуется острым течением, поражение органов дыхания, пищеварения, конъюнктивитом. У взрослых животных инфекция протекает бессимптомно. Установлено, что аденовирусы являются иммунодепрессантами и способствуют развитию вторичной инфекции. Клиникоэпизоотологическая диагностика АВИ КРС затруднена изза сходства с другими заболеваниями, поэтому главная роль отводится лабораторной диагностике.