Получение и биофизическое исследование меченных стабильными изотопами метаболитов и мембранных белков: методологии и перспективы

• Автор: Егорова, Татьяна Анатольевна
• Шифр специальности: 03.01.06, 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 275 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОТ ИСТОЧНИКА К ЦЕЛЕВОМУ ПРОДУКТУ

ПОТЕНЦИАЛ ПРИРОДНОГО РАЗНООБРАЗИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ ,3С, ,5

1.1 Потенциал меченных стабильными изотопами,

биологически активных соединений

1.2 Водоросли для битехнологии от вида к продукту

1.3 Археи и бактерии.

1.4 Дрожжевые экстракты как компоненты питательных сред

1.5 Мониторинг состава биомасс из различных источников методом ИК

ГЛАВА 2. МЕЧЕННЫЕ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ АМИНОКИСЛОТЫ И ПЕПТИДЫ ДЛЯ ПРОТЕОМИКИ И СТРУКТУРНОЙ БИОЛОГИИ
2.1 Меченные стабильными изотопами аминокислот ы
2.2 Меченные стабильнымиизотопами пептаиболы
ГЛАВА 3. МЕЧЕННЫЕ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ
НАСЕКОМЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКОВМИШЕНЕЙ
3.1 Меченные стабильными изотопами клеточные линии млекопитающих.
3.2 Меченные стабильными изотопами клеточные линии насекомых
ГЛАВА 4. СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕМБРАННЫХ КОМПЛЕКСОВ СТРАТЕГИИ ТОТАЛЬНОГО МЕЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ
4.1 Характеристика I3,I51 пигментов
химические сдвиги ,3С, , в растворе и твердом теле.
4.2 3,, лиганд в мембранном белковом комплексе
лнгандбелковые взаимодействия.
4.2.1 Фотосиптетическис РЦ с ,3 а
4.2.2 Фотосинтстнческис РЦ с ,5 а.
4.2.3 Фотосинтетические СК2 с I3, а В0 и ,,5 СК2. Электронная структура кофакторов, кофакторкофакторные
п кофакторбелковыс взаимодействия
4.3 Тотально меченный стабильными изотопами мембранный белковый комплекс
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.
ПРИЛОЖЕНИЯ
ОТ АВТОРА.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Раствор солюбилизированных мембран в количестве 6 мл наносили на приготовленный 1 или 2 и центрифугировали при ,0 обмин в течение часов при 4С . После разделения было чтко видны три полосы нижняя соответствующая СК1РЦ, средняя СК2 комплекс, и верхняя, содержащая другие белки и свободные пигменты. Каждый слой выделяли в виде трх фракций и измеряли оптические спектры. После оценки чистоты объединяли фракции с одинаковой чистотой для дальнейших экспериментов. Фракции характеризовались соотношениями 0 4 для СК2 комплекса и соотношением АцК8оА0 2. СК1РЦкомплскса. Солюбилизованные белки диализовали три раза при температуре 4С с использованием буфера В. Буфер меняли каждые 5 часов, при этом старались сократить время диализа ввиду уменьшения стабильности белков со временем. Диализованные растворы концентрировали с помощью 0 кДа пробирок i до оптической плотности минимум 0 см1 при 0 нм в случае СК2 и при 0 нм в случае СК1РЦкомплскса соответственно и хранили при С. В случае частичного разрушения мембранных белков их очистку повторяли с помощью колоночной хроматографии по известной процедуре, применяемой для i РЦ. При этом белки элюировали градиентом 00 мМ в мМ i ,0. М буффер Г и диализовали при 4С в течение трх раз с использованием буфера В. Очшценыс белки концентрировали с помощью i на центрифужной фильтровальной установке ix0, 0. СК2 и 0 нм дляСК1РЦ и хранили приС. В работе использовали соникатор Vi тип i для разрушения клеток, а также сверхскоростную центрифугу V 5 и ультрацентрифугу i . Оптические спектры измеряли с помощью спектрофотометра типа i, V0. Для концентрирования белковых комплексов, применялись пробирки 1 i . По сравнению с известными методиками по выделению мембранных белков, сахарозный градиент применяли с помощью более концентрированного исходного материала с не менее 0 см1 при 0 нм по сравнению с нагрузками, применявшимися ранее с см1. Чистоту выделеных белков характеризовали МЗМерСНИСМ ОНТИЧеСКОГО СИСКТра См. ИС 1. И Определения СООТНОШеНИЯ АвА0 для СК2. АВ0А0 Для IРЦ мембранного комплекса. Для СК2 комплекса отношение АвАг7о составило 3. СК1РЦ 0 1. При культивировании изменение интенсивности света позволяло изменять соотношение между двумя мембранными комплексами в биомассе фотосинтетических бакгерий. Фотосинтетические бактерии выращивали при интенсивности света Люкс и Люкс. Было найдено, что, выращивание при более высокой интенсивности света Люкс приводило к более высокому содержанию IРЦ комплекса, а использование низкой интенсивности света приводило к образовывают, в основном, СК2 в качестве целевого продукта. Таким образом, соотношение между двумя комплексами СК2 и СК1РЦ изменялось от 81 до 41 при интенсивностях света Люкс или Люкс соответственно. В ходе исследования также изучали стабильность IРЦ и СК2 комплексов. Было показано, что СК2 более устойчив к изменению температур по сравнению с IРЦ. Наблюдали, что в случае IРЦ при температуре 4 С соотношение А0А0 уменьшалось до 0. Таким образом, сразу же после выделения мембранных комплексов рекомендуется их хранение при температуре С и проведение работы с этими мембранными комплексами при температуре не выше 0С. Выделенные мембранные комплексы использовались для изучения их строения методом атомной силовой спектроскопии. Рис 1. Спектр поглощения фотосинтетических мембранных комплексов, выделенных из биомассы . А СК2 и Б СК1РЦ. Разработанные условия культивирования и выделения мембранных комплексов использовались при выполнении экспериментов но I для последующего изучения фотосинтетических мембранных комплексов методом ЯМР и ИК спектроскопии, что подробно изложено в главе 4. Было уделено особое внимание оценке эффективности введения изотопной метки в мегилотрофные бакгерии, а также масштабированию процесса. В качестве примера на Рис. ИК спектр для природной и для 2 бактериальных биомасс. Известно, что колебательные полосы СН характеризуются меньшей интенсивностью по сравнению с СН . На основании сдвига вибрационных полос СН с использованием подходов , и фактора интенсивности сигналов 3.