Характеристика химического и антигенного составов гликополимеров поверхности бактерий Herbaspirillum seropedicae Z78 и Herbaspirillum lusitanum P6-12

• Автор: Величко, Наталья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 160 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Бактерии рода НегЬюртИит представители азотфиксирующих

диазотрофных ризобактерий

1.1.1 Физиологоморфологические особенности гербаспирилл

1.1.2 Исследование генома НегЬаБр 1гШит

1.1.3 Применение диазотрофных ризобактерий рода НегЬюртИит

1.2 Организация и функции наружной мембраны, капсулы и

межклеточного пространства грамотрицательных бактерий

1.3 Липополисахариды грамотрицательных бактерий
1.3.1 Общая характеристика липида А
1.3.2 Общая характеристика олигосахарида кора
1.3.3 Общая характеристика Оспсцифических полисахаридных цепей. Сгрукгурное разнообразие и вариабельность
1.4 Экзополисахариды грамотрицательных бактерий
1.4.1 Капсульные полисахариды
1.4.2 Экстраклсточные полисахариды. Внеклеточные липополисахариды
1.5 Функции экстаклсточных, капсульных и липополисахаридов в
растительномикробных взаимодействиях
1.6 Способы получения антител для иммунохимичсских исследований
1.6.1 Получение поликлональных антител
1.6.2 Получение моноклональных антител с использованием гибридомной технологии
1.6.3 Использование рскомбинаторной фаговой библиотеки для получения миниантител
1.7 Методы исследования иммунохимической специфичности полисахаридов поверхности
1.8 Методы выделения и исследования бактериальных полисахаридов
1.8.1 Выделение и очистка экзополисахаридов
1.8.2 Экстракция и фракционирование липополисахаридов
1.8.3 Разделение липидного и углеводного компонентов липополисахарида
1.8.4 Изучение строения Оснецифических полисахаридов
1.8.4.1 Деструктивные химические методы с применением газожидкостной хроматографии и массспектрометрии
1.8.4.2 Структурный анализ полисахаридов методом ядерного магнитного резонанса
1.9 Липополисахариды ii МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Микробиологические культуры и условия выращивания
2.2 Приборы и материалы
2.3 Микробиологические методы
2.3.1 Оценка чистоты культуры
2.3.2 Выявление капсулы
2.4 Методы выделения и исследования полисахаридов бактерий рода ii
2.4.1 Выделение полисахаридов из культуральной жидкости
2.4.2 Выделение полисахаридов из капсульного материала
2.4.3 Экстракция липополисахаридов
2.4.4 Хроматографические методы
2.4.4.1 Еельфильтрация
2.4.4.2 Газожидкостная хроматография и хроматомасс спектрометрия
2.4.4.2.1 Определение состава жирных кислог полисахаридов и липополисахаридов
2.4.4.2.2 Определение моносахаридного состава полисахаридов
2.4.5 Колориметрическое определение состава углсводсодержащих полимеров
2.4.6 Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле
2.4.7 Получение кроличьих антител
2.4.8 Получение миниантител
2.4.9 Твердофазный иммуноферментный анализ
2.4. Конкурентный иммуноанализ
2.4. Выделение Ополисахаридов кислотным гидролизом
липополисахаридов
2.4. ЯМР спектроскопия
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Выделение и исследование химического состава капсульных и
экстраклеточных полисахаридов
3.2 Выделение и исследование химического состава липополисахаридов
3.3 Иммунохимическое исследование гликополимеров бактерий рода
НегЬазрМИит
3.3.1 Сравнительный иммуиохимический анализ гликополимеров
Я. егореИсае и Я. ктШпит Р
3.3.2 Конкурентный иммуноанализ в оценке строения углеводных
эпитопов ЛПС бактерий Я. БегоресИсае Т
3.4 Исследование Оспецифического полисахарида
3.4.1 Выделение Оспсцифических полисахаридов, коровых
олигосахаридов и определение их моиосахаридного состава методом ГЖХ
3.4.2 Исследование структуры повторяющегося звена
Оспецифического полисахарида Я. зегоресИсае
3.4.2.1 Определение характера замещения моносахаридных 3 остатков методом метилирования с последующей ГЖХмассспектрометрией
3.4.2.2 Ни ьСЯМРспектроскопия
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Они увеличивают рост культур благодаря действию одного или нескольких факторов, например, за счет антагонистической активности против патогенов или фиксации атмосферного азота. Процессы ассоциативной азотфиксации и эффективной сгимуляции роста возможны только при условии успешной колонизации , V i, i, . Однако природа такого взаимодействия недостаточно изучена, что, в отличие от хорошо исследованного бобоворизобиального симбиоза, связано с трудностями в оценке азотфиксации в колонизированном растении и процессах проникновения бактерий в организм хозяина. Ассоциативная азотфиксация является важнейшим звеном в глобальном цикле азота и, наряду с фиксацией углекислоты, обеспечивает продуктивность биосферы вцелом. Многие природные экосистемы лимитированы по доступным соединениям азота, что придает этому процессу особое значение в круговороте биогенных элементов. Мишустин и Шильникова, Онофраш с соавт. Микроорганизмы, находящиеся в ассоциативном симбиозе с растением, поставляя различные фитогормоны и витамины, получают от него, в свою очередь, питательные вещества Завалин с соавт. Биологически активные соединения, продуцируемые бактериями, попадая внутрь макрохозяина через корневую систему, активизируют процессы роста и оказывают существенное влияние на обмен веществ во всем организме Филимонова, , . Очень актуальными являются исследования, связанные с использованием этого феномена для повышения урожайности с ел ьскохозя й ствен н ы х кул ьту р. В настоящее время несимбиотические бактерии, фиксирующие молекулярный азот и колонизирующие злаковые растения, разделяют на три группы свободноживущие ризосферные организмы, факультативные и облигатные эндофиты i , . В первую категорию включают все виды, обладающие способностью колонизировать поверхность корня, такие как i, iii . Во вторую заселяющие поверхность и внутренние ткани корней. Эта группа образована, главным образом, видами рода ii, исключая . К облигатным относят представителей, выделенных из внутренних тканей подземных и наземных органов растений i i , i ii , . Термин эндофиты стал применяться но отношению к микроорганизмам бактериям и грибам, колонизирующим внутренние ткани корня, которые существуют, частично или полностью, за счет внутренних ресурсов организмахозяина, не вызывая при этом какихлибо симптомов патогенеза комменсализм. Позднее это понятие было расширено для бактерий и грибов, живущих внутри растений и приносящих им пользу мутуализм , . Благодаря способности отдельных бактерийдиазотрофов, сохраняющих низкую жизнеспособность в почве, заселять корневую систему злаковых и фиксировать азот в ассоциации с этими растениями, термин эндофиты был интродуцирован к данной группе микроорганизмов i, а. В органах растений не происходи интенсивного размножения и накопления значительной биомассы эндофитных бактерий Каратыгин и Нездойминого, , то есть данный тип ассоциаций имеет скрытый характер. Ранее эндофитность ассоциативных микроорганизмов доказывалась на основании изучения их колонизационного потенциала, пространственных взаимоотношений, способности положительно влиять на рост и развитие макропартнера Емцев с соавт. Стоит подчеркнуть, что большинство из них не накапливается в почве в отсутствии макрохозяина i . В настоящее время использование современных микроскопических методов позволяет не только обнаружить данные микроорганизмы, но и оценить их локализацию . Одним из подобных организмов, найденных в корнях, побегах и листьях различных растений, включая экономически важные сельскохозяйственные виды, такие как рис, кукуруза, сахарный тростник, свекла, являются бактерии рода i ii. Первое упоминание о гсрбаспириллах появилось в году. Балдани с соавторами, основываясь на данных о форме клетки, поведении и среде обитания, выделили, как им казалось, новый вид ii i, . Генетические исследования опровергли это предположение. Балдани и Фалк с соавторами показали, что данные микроорганизмы относятся к Рсубклассу i и выделили новый род ii, с единственным на тот момент представителем И. Национального центра Агробиологии в i, Рио де Жанейро, Бразилия i, . Позднее род ii был пополнен еще одним видом. Н. ii iv .